| 研究課題/領域番号 |
14770082
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
人体病理学
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
橋口 明典 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (50276218)
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| 研究期間 (年度) |
2002 – 2003
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| 研究課題ステータス |
完了 (2003年度)
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| 配分額 *注記 |
3,900千円 (直接経費: 3,900千円)
2003年度: 1,900千円 (直接経費: 1,900千円)
2002年度: 2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
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| キーワード | ヒト抗体 / ベロ毒素 / CD26 |
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| 研究概要 |
ベロ毒素、ならびにヒトCD26を、ヒト末梢血リンパ球を移植したCB-17 SCIDマウス(SCID-huPBL)に免疫し、脾臓に集積したヒトリンパ球より、可変領域のcDNAライブラリーを得た。アセンブリPCR法により、γ鎖とκ鎖、γ鎖とλ鎖、それぞれを対にして組み合わせ、ファージミドベクターに組み込み、single chain Fv (scFv) cDNAライブラリーの作製に成功した。
ファージ・ディスプレー法にて、それぞれ目的の抗原と結合するクローンを濃縮し、ELISA法にて陽性を示すクローンを多数得た。
ELISAにて、抗原量に比例してシグナル強度があがる特異性の高いクローンを選択し、大量精製を目的として、ヒスチジン・タグを付加するタンパク発現系への組み換えを行った。組み換え後も、ヒスチジン・タグを有する30kDの安定した蛋白の発現をイムノブロッティング法にて確認した。
これらのクローンについては、それぞれ塩基配列を決定し、各々は、塩基配列の異なる独立したクローンであることを確認した。各クローンの遺伝子産物をイムノブロッティング法にて解析したところ、それぞれ約30kDの安定した蛋白(scFv)を産生することが明らかとなった。
各クローンは、Niイオン親和性クロマトグラフィーにて約90%以上の純度で精製に成功した。
細胞表面上のCD26の認識が可能か検討する目的で、CD26を導入したJurkat細胞株に精製scFvを作用させ、二次抗体に、FITC結合抗mycエピトープ抗体を用いて、フローサイトメーターにて検討した。陰性コントロールとして、CD26を導入していないJurkat細胞の親株を用いた。各クローンとも、特異的陽性所見が得られた。
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