| 研究課題/領域番号 |
14770093
|
|---|
| 研究種目 |
若手研究(B)
|
| 配分区分 | 補助金 |
|---|
| 研究分野 |
実験病理学
|
|---|
| 研究機関 | 浜松医科大学 |
|---|
研究代表者 |
土田 孝 浜松医科大学, 医学部, 助手 (30317755)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2002 – 2003
|
| 研究課題ステータス |
完了 (2003年度)
|
| 配分額 *注記 |
2,600千円 (直接経費: 2,600千円)
2003年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
2002年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
|
|---|
| キーワード | リボザイム / マウスサイトメガロウイルス / 前初期(IE)遺伝子 / 増殖抑制 / 潜伏感染 / 分化誘導 |
|---|
| 研究概要 |
マウスサイトメガロウイルス(MCMV)前初期(IE)遺伝子を標的としたリボザイムの作成
マウスCMV(MCMV)のIE遺伝子のうちIE1とIE3に共通なmRNAに対するハンマーヘッド型リボザイムを数種類設計し、in vitro cleavageにて切断活性を確認した。
MCMV IE mRNAを標的としたリボザイムの培養細胞への導入と発現
in vitro cleavageの結果より、切断活性の高いリボザイムをtRNAプロモーターとpuromycin耐性遺伝子もつplasmidベクターに挿入した。このリボザイム発現ベクターをNIH3T3細胞にトランスフェクションし、puromycin耐性クローンを作製し、リボザイム高発現クローンをRT-PCRで確認した。
リボザイム発現細胞におけるMCMV IE遺伝子産物の発現抑制と感染抑制の確認
リボザイム高発現細胞および対照NIH3T3にMCMVを感染させた。MCMV IE遺伝子産物の発現をIE1特異抗体(N2)、を用いたフローサイトメトリーで経時的な解析を施行したところ、リボザイム高発現細胞では対照NIH3T3と比較して10倍程度のIE発現抑制効果を確認した。また、培養上清および細胞ホモジネートとマウス胎児線維芽細胞を用いたプラークアッセイによってもウイルス増殖抑制効果が確認された。
MCMV潜伏感染モデルにおけるウイルス増殖抑制の試み
F9細胞(teratocarcinoma cell line)にリボザイム発現ベクターを導入しリボザイム発現クローンを作成した。GFP発現MCMV感染後72時間のリボザイム発現クローンと対照F9をレチノイン酸により分化誘導したところ2週間後のGFP発現に著明な差がみられた。増殖抑制効果は、プラークアッセイとN2を用いたフローサイトメトリーによっても確認された。
|
