| 研究課題/領域番号 |
14780468
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
生物有機科学
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| 研究機関 | 独立行政法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
濱田 季之 独立行政法人理化学研究所, タンパク質機能研究チーム, 研究員 (40321799)
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| 研究期間 (年度) |
2002 – 2003
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| 研究課題ステータス |
完了 (2003年度)
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| 配分額 *注記 |
3,200千円 (直接経費: 3,200千円)
2003年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
2002年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
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| キーワード | 海綿 / 細胞毒性物質 / 作用機序 / 標的タンパク質 / アフィニティークロマトグラフィ / 光親和性標識 / リボソーム / 細胞毒性 / 活性発現メカニズム / アフィニティーカラ / MALDI-TOF MS / 一次構造データベース / HeLa細胞 |
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| 研究概要 |
海綿Theonella swinhoeiから単離された細胞毒性物質onnamide Aの作用機序を明らかにするため、その標的タンパク質を探索した。
まず、onnamide Aアフィニティークロマトグラフィーを用いた標的タンパク質の網羅的探索として、onnamide Aの直鎖状構造部分のカルボン酸を介してaminoalkyl agarose gelとstreptavidin gelにそれぞれ結合させた。タンパク質源としてHeLa細胞の細胞質画分を用い、標的タンパク質を精製したところ、SDS-PAGE上で十数種の標的タンパク質に対応するバンドを検出した。それらのバンドは、アミノ酸N末シークェンス法やpeptide mass finger printing法により同定した。
次に、光親和性標識化合物(アフィライト-CHO)とonnamide Aを化学結合させ、それをプローブとして標的タンパク質を探索した。光親和性標識onnamide AをHeLa細胞の細胞質画分と80Sリボソーム画分のそれぞれと混合し、SDS電気泳動、続くウェスタンブロッテイング後にAP標識ストレプトアビジンを用いた化学発光により、細胞質画分では1種(50kDa)、80Sリボソーム画分からは数種(50kDa,35-40kDa,15kDa)の標的タンパク質に対応するバンドを検出した。これらのバンドについては、peptide mass finger printing法などを用いて同定を行なう予定である。
これまでの研究及び知見から、onnamide Aは、pederin同様、リボソームと相互作用していることが分かった。今後は、リボソーム画分からの標的タンパク質の探索、同定を進め、onnamide Aの作用機序について考察する予定である。
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