| 研究課題/領域番号 |
14780482
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
構造生物化学
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| 研究機関 | 独立行政法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
関根 俊一 独立行政法人理化学研究所, 細胞情報伝達研究室, 研究員 (50321774)
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| 研究期間 (年度) |
2002 – 2003
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| 研究課題ステータス |
完了 (2003年度)
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| 配分額 *注記 |
3,900千円 (直接経費: 3,900千円)
2003年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
2002年度: 2,500千円 (直接経費: 2,500千円)
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| キーワード | aminoacylation / aminoacyl-tRNA synthetase / crystallization / tRNA / X-ray crystallography |
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| 研究概要 |
結晶化を行うためのタンパク質およびRNA試料を調製するために、ヒト由来グルタミルプロリルtRNA合成酵素(GluProRS)およびそれと相互作用するtRNA遺伝子のクローニングを行った。はじめに、ヒト肝臓由来cDNAライブラリーに対して、GluProRSの遺伝子の5'末端と3,末端に相補的な配列をもったプライマーを合成してPCRを行い、完全長の構造遺伝子(4,320塩基対)を増幅し、クローニングすることに成功した。大腸菌内で本タンパク質を発現させるために、汎用されているpET系ベクターに遺伝子をサブクローニングし、発現を試みたが、目的タンパク質の発現は認められなかった。GluProRSの大腸菌における細胞毒性の可能性を考慮し、酵母にみられるprotein splicingを応用したIMPACTシステムに遺伝子を組み換えて発現を試みたが、目的タンパク質を効率よく発現させることはできなかった。一方、目的タンパク質と相互作用するtRNAの遺伝子をクローニングし、発現・精製することには成功した。現在は、GluProRSの全長ではなく、機能をもったドメインを発現させて構造解析のターゲットとするための実験を行っている。
また、古細菌由来のGluRSは、真核生物由来のGluRSと高い相同性をもっていることが知られているので、試料調製の比較的容易な古細菌由来のGluRSの結晶構造解析をめざした試料調製も開始した。複数の古細菌(Aeropyrum perinix、Sulfolobus tokodaii)から、GluRSおよびtRNAの遺伝子をクローニングし、それぞれの発現系を構築した。GluRSタンパク質およびtRNAを精製し、それらの複合体の結晶化を行っている。
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