ゲンジボタル・ルシフェラーゼの発光反応中間状態構造の高分解能X線結晶構造解析

• 研究課題/領域番号: 14780483
• 研究種目: 若手研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 構造生物化学
• 研究機関: 京都大学 (2003); 特殊法人理化学研究所 (2002)
• 研究代表者: 中津 亨 京都大学, 薬学研究科, 助教授 (50293949)
• 研究期間 (年度): 2002 – 2003
• 研究課題ステータス: 完了 (2003年度)
• 配分額: 3,400千円 (直接経費: 3,400千円); 2003年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円); 2002年度: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
• キーワード: ルシフェラーゼ / 生物発光 / X線結晶構造解析 / 中間体アナログ / ルシフェリン

研究概要

ホタルのルシフェラーゼによる発光反応は発光基質であるルシフェリンがMgATPにより活性化され、Luciferyl AMP中間体を酵素中でいったん形成する。そこへ酸素が攻撃することにより、AMPが放出され、生成したオキシルシフェリンが励起状態から基底状態に移るときに発光が生じると考えられている。この発光反応のメカニズムを明らかにするときに鍵となるのは、いかにしてLueiferyl AMP中間体が生成され、どのような状態で存在しているかということである。しかしその中間状態をX線結晶構造解析により直接捕まえることは困難であった。そこで中間状態を明らかにするため、中間体のルシフェリン部分をデヒドロルシフェリン、リン酸基をスルファモイル基に変換したDehydroluciferyl Sulfamoyl Adenosine (DLSA)中間体アナログを合成した。そしてこの中間体アナログがルシフェラーゼ中でどのような構造をしているのかを明らかにするため、ルシフェラーゼ:DLSA複合体のX線結晶構造解析を行った。ルシフェラーゼとあらかじめインキュベートし、結晶化を行ったところ、PEG4000を沈殿剤として用いたときに良好な結晶が得られた。大型放射光施設SPring-8のビームラインBL45PXにおいてX線回折実験を行ったところ1.3Å分解能の回折強度データが得られ、精密化を行った結果、DLSAを示す非常にきれいな電子密度が得られた。その立体構造から中間体構造の安定化に寄与している残基としては近傍に存在するHisおよびThr残基が示唆された。
また赤色発光を行う変異型酵素に関しても同様の立体構造決定を行い、野生型酵素との立体構造比較を行った。その結果、ルシフェリン付近のベータシート構造の位置が動いていることが判明し、この構造の違いが発光色の違いを反映している可能性が示唆された。

研究成果

• [文献書誌] Ifuku K, Nakatsu T, Kato H, Sato F.: "Crystal structure of the PsbP protein of photosystem II from Nicotiana tabacum"EMBO Report. (in press). (2004)
• [文献書誌] Matsubara M, Nakatsu T, Kato H, Taniguchi H: "Crystal structure of a myristoylated CAP-23/NAP-22 N-terminal domain complexed with Ca(2+)/calmodulin."EMBO Journal. 23(4). 712-718 (2004)
• [文献書誌] Ifuku K, Nakatsu T, Kato H, Sato F.: "Crystallization and-preliminary crystallographic studies on the extrinsic 23kD protein in the oxygen-evolving complex of photosystem II."Acta Crystallogr D. 59(Pt8). 1462-1463 (2003)
• [文献書誌] Yamashita A, Endo M, Higashi T, Nakatsu T, Yamada Y, Oda J, Kato H.: "Capturing enzyme structure prior to reaction initiation : tropinone reductase-II-substrate complexes"Biochemistry. 42(19). 5566-5573 (2003)
• [文献書誌] Yamauchi, E., Nakatsu, T., Matsubara, M., Koto, H., Taniguchi H.: "Crystal structure of MARCKS calmodulin-binding domain peptide complexed with Ca^<2+> Calmodulin"Nature Structural Biology. (In press). (2003)
• [文献書誌] Shimizu, T., Nakatsu, T., Miyairi, K., Okuno, T., Kato, H.: "Active-Site Architecture of Endopolygalacturonase I from Stereum purpureum Revealed by Crystal Structures in Native and Ligand-Bound Forms at Atomic Resolution"Biochemistry. 41. 6651-6659 (2002)
• [文献書誌] Irie, K., Nakatsu, T., Mitsuoka, K., et al.: "Crystal Structure of the Homer 1 Family Conserved Region Reveals the Interaction Between the EVH1 Domain and Own Proline-rich Motif"Journal of Molecular Biology. 318. 1117-1126 (2002)