| 研究課題/領域番号 |
14780515
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
生物物理学
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| 研究機関 | 横浜市立大学 |
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研究代表者 |
橋本 博 横浜市立大学, 大学院・総合理学研究科, 助手 (40336590)
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| 研究期間 (年度) |
2002 – 2003
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| 研究課題ステータス |
完了 (2003年度)
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| 配分額 *注記 |
3,400千円 (直接経費: 3,400千円)
2003年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
2002年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
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| キーワード | 損傷乗り越えDNA合成 / DNAポリメラーゼκ / ベンゾピレン / 結晶化 / DNAポリメラーゼ |
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| 研究概要 |
ヒトDNAポリメラーゼκ(pol κ)は870アミノ酸からなる分子量100kpaのDNA合成酵素である。pol κは、タバコの煙や排煙中に含まれるベンゾピレンによって損傷したDNAを鋳型にして、正しくDNAを複製できるため、損傷乗り越え型DNA合成酵素として注目されている。pol κ全長は、触媒活性を有するN末65kDaとC末35kDaに分解されやすい。そこで、まずはN末65kDa(pol κ ΔC)をターゲットとし、発現・精製・結晶化を行った。C末に6残基のヒスチジンを付加させたpol κ ΔCを大腸菌内に大量発現させ、菌体を超音波破砕し、ニッケルアフィニティー樹脂Ni-NTA、および陽イオン交換カラムHiTrapSP、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーで精製を行い、純粋なpol κ ΔCを得ることに成功した。pol κ ΔCを濃縮し、pol κ ΔC単独及び、DNA複合体での結晶化条件の検索を行った。3,000条件を超える条件検討を行った結果、MPDを沈殿剤とした場合に板状の微結晶が得られたが、X線回折実験に適した結晶を得ることができなかった。
結晶構造解析に適したpol κ ΔCの結晶が得られない理由として、本来あるべきC末領域がないため、揺らぎの大きな構造となり、結晶化しにくいのではないかと考えた。そこで、全長pol κをターゲットとし、全長pol κの大量発現、精製を試みた。全長pol κを大腸菌内で発現させた場合、pol κの発現量は極めて少なく、純粋なpol κを精製することがこれまで困難であった。しかし今回、培養条件およびIPTG誘導の条件を詳細に検討したところ、全長pol κの発現量を増加させることに成功した。さらにpol κ ΔCと同様な精製プロトコルで純粋な全長pol κを得ることができた。現在は、全長pol κ及びそのDNA複合体での結晶化を行うとともに、pol κ ΔC-DNA複合体の結晶化条件の最適化を行っているが、これまでにX線回折実験に適した結晶は得られていない。
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