| 研究課題/領域番号 |
14780628
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
実験動物学
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| 研究機関 | (財)実験動物中央研究所 |
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研究代表者 |
六車 香里 (財)実験動物中央研究所, 遺伝研究室, 研究員 (50290979)
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| 研究期間 (年度) |
2002 – 2003
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| 研究課題ステータス |
完了 (2003年度)
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| 配分額 *注記 |
2,700千円 (直接経費: 2,700千円)
2003年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
2002年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
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| キーワード | PVRマウス / 導入遺伝子 / モニタリング / ポリオウィルス / 安定性 |
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| 研究概要 |
本年度は、導入遺伝子近傍のゲノム領域のクローニングと遺伝子型スクリーニング法の開発を行った。
a.導入遺伝子と宿主ゲノムのジャンクション部位のクローニング:ジャンクション部位をカバーした約3kbの断片が得られる制限酵素BglIIによりTgホモ個体ゲノムDNAを消化し、ショ糖密度勾配遠心法によってジャンクション部位を含む断片を回収した。inverted PCR法により塩基配列が未知であるゲノム領域を増幅し、得られたPCR産物のダイレクトシークエンシングにより、導入遺伝子より上流のゲノム領域約1kbをクローニングした。ホモロジー検索の結果、第13染色体B3領域にマップされているBAC Clone No.RP23-62F4(全長約324kb)の一部と配列が一致した。
b.PCRによる遺伝子型スクリーニング法の確立:a.の解析結果から、遺伝子が導入された座位の野生型アレルを検出するプライマーセットAを設計し、導入遺伝子を検出するプライマーセットBと共にduplex PCRを行った。PCR産物を視覚化した際に、Tgヘミ個体は野生型アレルと導入遺伝子、Tgホモ個体は導入遺伝子のみのバンドが検出されるようduplex PCRの条件設定を行ったが、Tgホモ個体において野生型アレルの非特異的なバンドが出現したことから、ヘミおよびホモ個体の判別が困難であり、本法による遺伝子型スクリーニングは有効ではないと判断した。そこで、導入遺伝子近傍に残存しているファウンダー系統(ICR)のゲノム領域に着目し、ICRと本マウスのレシピエント系統であるIQIとの間で多型を示し、かつTgと強く連鎖するマイクロサテライトマーカーの検索を行った。その結果、導入遺伝子より約2.0cMの距離に位置するD13Mit10を見出した。本マーカーはホモ個体においてICRタイプのホモ型、ヘミ個体においてICRタイプとIQIタイプのヘテロ型を示すとことから、ヘミおよびホモ個体の判別に有用であると考え、来年度より本マーカーを用いた遺伝子型スクリーニングを実施することとした。
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