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アプタマーテクノロジーを利用した新規高感度植物ウイルス・ウイロイド診断法の開発

研究課題

研究課題/領域番号 14F04078
研究種目

特別研究員奨励費

配分区分補助金
応募区分外国
研究分野 植物保護科学
研究機関弘前大学

研究代表者

佐野 輝男  弘前大学, 農学生命科学部, 教授 (30142699)

研究分担者 KAPONI MARIA  弘前大学, 農学生命科学部, 外国人特別研究員
KAPONI Maria  弘前大学, 農学生命科学部, 外国人特別研究員
研究期間 (年度) 2014-04-25 – 2017-03-31
研究課題ステータス 完了 (2016年度)
配分額 *注記
2,300千円 (直接経費: 2,300千円)
2016年度: 700千円 (直接経費: 700千円)
2015年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
2014年度: 400千円 (直接経費: 400千円)
キーワードウイロイド / アプタマー / セレックス / 次世代シークエンス解析 / DNAアプタマー / ビオチンラベルプライマー / 磁気ビーズ / 核酸アプタマー / 高感度診断技術
研究実績の概要

アプタマー選抜の中核技術となるSELEX法には様々な因子が関与するため、ランダムオリゴ配列の長さ、濃度、温度、分離方法などを最適化する必要がある。特異な高次構造を有する自己複製型RNA病原体であるウイロイドを標的とするアプタマーを選抜するためのSELEX法プロトコールの確立を目指し、以下の諸条件を最適化し、アプタマー候補配列の濃縮に成功した。
まずビオチン化標的PSTVd分子に結合したssDNAはストレプトアビジンコート磁気ビーズで回収する。市販の数種類の磁気ビーズを試し、ダイナビーズM-270(インビトロジェン社)とダイナビーズC1(インビトロジェン社)を選定し、ダイナビーズT1/M280とマグネスフェアーSA-PMPs(プロメガ社)が相補鎖分離に効果的である結果を得た。
次に、SELEX法の結合、洗浄、溶出緩衝液のモル濃度、処理条件、競合実験条件等を検討し、最終的に6.32ピコモルの弱結合コントロールと20塩基、30塩基、40塩基のランダムDNAライブラリーから15ラウンドのSELEX選抜で濃縮したssDNA集団と10倍段階希釈した陽性対照混合液を、62ピコモルの標的PSTVd分子が結合している磁気ビーズに加える実験条件を確立した。因みにこの時の標的分子と結合分子(アプタマー候補分子)の比率は約10:1になる。また、1、5、10ラウンド目のssDNA試料の一部をPCR-クローニング後、塩基配列を分析し、さらに、10ラウンド目の試料を次世代シークエンス・アンプリコン解析にかけ、集団内の多様性を分析し、アプタマー候補となりうる配列を濃縮することに成功した。

現在までの達成度 (段落)

28年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

28年度が最終年度であるため、記入しない。

報告書

(3件)
  • 2016 実績報告書
  • 2015 実績報告書
  • 2014 実績報告書
  • 研究成果

    (2件)

すべて 2016

すべて 雑誌論文 (1件) (うち国際共著 1件) 学会発表 (1件) (うち国際学会 1件)

  • [雑誌論文] Viral pathogens occurring in fig-mosaic diseased trees in Greece2016

    • 著者名/発表者名
      Kaponi, M.S., Vellios, E.K., Fillipou, K.S., Sano, T.
    • 雑誌名

      PSJ Plant Virus Disease Workshop Report. Special Edition

      巻: 12 ページ: 30-42

    • 関連する報告書
      2016 実績報告書
    • 国際共著
  • [学会発表] A method of selecting aptamers against Potato Spindle Tuber Viroid (PSTVd)2016

    • 著者名/発表者名
      Kaponi M.S., Kashiwagi A., Sano T
    • 学会等名
      International RNA Meeting RNA2016
    • 発表場所
      京都市、京都国際会議場
    • 年月日
      2016-06-28
    • 関連する報告書
      2015 実績報告書
    • 国際学会

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公開日: 2015-01-22   更新日: 2024-03-26  

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