| 研究課題/領域番号 |
14F04078
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| 研究種目 |
特別研究員奨励費
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 外国 |
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| 研究分野 |
植物保護科学
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| 研究機関 | 弘前大学 |
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研究代表者 |
佐野 輝男 弘前大学, 農学生命科学部, 教授 (30142699)
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| 研究分担者 |
KAPONI MARIA 弘前大学, 農学生命科学部, 外国人特別研究員
KAPONI Maria 弘前大学, 農学生命科学部, 外国人特別研究員
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-25 – 2017-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2016年度)
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| 配分額 *注記 |
2,300千円 (直接経費: 2,300千円)
2016年度: 700千円 (直接経費: 700千円)
2015年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
2014年度: 400千円 (直接経費: 400千円)
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| キーワード | ウイロイド / アプタマー / セレックス / 次世代シークエンス解析 / DNAアプタマー / ビオチンラベルプライマー / 磁気ビーズ / 核酸アプタマー / 高感度診断技術 |
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| 研究実績の概要 |
アプタマー選抜の中核技術となるSELEX法には様々な因子が関与するため、ランダムオリゴ配列の長さ、濃度、温度、分離方法などを最適化する必要がある。特異な高次構造を有する自己複製型RNA病原体であるウイロイドを標的とするアプタマーを選抜するためのSELEX法プロトコールの確立を目指し、以下の諸条件を最適化し、アプタマー候補配列の濃縮に成功した。
まずビオチン化標的PSTVd分子に結合したssDNAはストレプトアビジンコート磁気ビーズで回収する。市販の数種類の磁気ビーズを試し、ダイナビーズM-270（インビトロジェン社）とダイナビーズC1（インビトロジェン社）を選定し、ダイナビーズT1/M280とマグネスフェアーSA-PMPs（プロメガ社）が相補鎖分離に効果的である結果を得た。
次に、SELEX法の結合、洗浄、溶出緩衝液のモル濃度、処理条件、競合実験条件等を検討し、最終的に6.32ピコモルの弱結合コントロールと20塩基、30塩基、40塩基のランダムDNAライブラリーから15ラウンドのSELEX選抜で濃縮したssDNA集団と10倍段階希釈した陽性対照混合液を、62ピコモルの標的PSTVd分子が結合している磁気ビーズに加える実験条件を確立した。因みにこの時の標的分子と結合分子（アプタマー候補分子）の比率は約10：1になる。また、1、5、10ラウンド目のssDNA試料の一部をPCR－クローニング後、塩基配列を分析し、さらに、10ラウンド目の試料を次世代シークエンス・アンプリコン解析にかけ、集団内の多様性を分析し、アプタマー候補となりうる配列を濃縮することに成功した。
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| 現在までの達成度 (段落) |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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