| 研究課題/領域番号 |
14J01576
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| 研究種目 |
特別研究員奨励費
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 国内 |
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| 研究分野 |
構造生物化学
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
林 克彦 大阪大学, 薬学研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-25 – 2017-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2016年度)
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| 配分額 *注記 |
3,200千円 (直接経費: 3,200千円)
2016年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
2015年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
2014年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
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| キーワード | X線結晶構造解析 / 多剤排出トランスポーター / トランスポーター / 多剤耐性菌 |
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| 研究実績の概要 |
多剤耐性菌感染症の克服に向け、菌の薬剤耐性獲得および菌の毒性発現に関与する薬剤排出トランスポーターの阻害剤開発を目指し、以下の３つの課題に取組んだ。（1.緑膿菌RND型トランスポーターMexYの構造解析 2.大腸菌多剤排出システムAcrAB-TolC複合体の結晶構造解析 3.マクロライド系抗生物質排出ABCトランスポーター MacBの結晶構造解析）
平成28年度は目標に対し次の事が明らかとなった。
1.MexY結晶を用いて大型放射光施設SPring 8で得たX線回折データから分子置換法で位相決定し、MexY構造を新たに決定することに成功した。しかしながら、この構造は薬剤認識・排出機能の議論をすることが難しいMexY単量体構造であった。そこで、より強固な三量体を構成するMexY変異体を作製し、このMexY変異体の薬剤耐性能および排出機能を保持することを確かめた。現在は、この変異体MexYの結晶化に取り組んでいる。
2.前年度までにリンカー配列を最適化した1:1構成比のAcrB-AcrA融合たんぱく質を用いた発現量活性相関から、融合たんぱく質がそれ単体で排出活性を有することを確かめた。AcrBとTolCの間では、システイン残基を適当な場所に導入すると生理的条件で直にジスルフィド架橋を形成する。AcrB-AcrA融合蛋白質でも同様に架橋が形成されることを確かめ、親和性タグでの精製を最適化し、架橋を持ったAcrAB-TolC複合体の精製法を確立した。精製した複合体をネガティブ染色と透過型電子顕微鏡により観察すると、大きさの揃った粒子が観測された。この三者複合体の構造決定を単粒子像再構成により目指している。
3.MacBの発現系を見直し、コムギ無細胞発現システムにより全長MacBを発現させた。リポソームに発現したMacBを用いて結晶化条件探索をしたが、結晶は得られていない。精製法、結晶化条件の検討を続け、構造解析可能な結晶の調製を目指す。
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| 現在までの達成度 (段落) |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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