電気化学高速ＡＦＭと構造解析を用いた新規キノヘモプロテインの電子移動機構の解析

• 研究課題/領域番号: 14J08641
• 研究種目: 特別研究員奨励費
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 国内
• 研究分野: 生体関連化学
• 研究機関: 東京農工大学
• 研究代表者: 武田 康太 東京農工大学, 大学院工学研究院, 特別研究員(PD)
• 研究期間 (年度): 2014-04-25 – 2016-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2015年度)
• 配分額: 1,900千円 (直接経費: 1,900千円); 2015年度: 900千円 (直接経費: 900千円); 2014年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
• キーワード: 酸化還元タンパク質 / ピロロキノリンキノン / ヘム / セロビース脱水素酵素 / 糖質関連酵素 / 生物電気化学 / 電子移動 / 高速AFM / PQQ / セロビオース脱水素酵素

研究実績の概要

真核生物由来で初のピロロキノリンキノン(PQQ)酵素である担子菌Coprinopsis cinerea由来ピラノース脱水素酵素(CcPDH)は、新規PQQドメインに加えて、シトクロムドメインとセルロース結合性ドメインを有した、構造的に特徴のある菌体外酸化還元酵素である。
全長酵素及び、各ドメインをそれぞれ切り離した組換え体を用いてその酵素学的性質を明らかとした。特徴的な性質として、逆いす形配座の立体配置をとる単糖に対して認識すること、セロビオース脱水素酵素のヘムドメインと類似した性質を有していること、さらにセルロースへの強い吸着能があることがわかった。各ドメインで至適pHが異なることを見出し、全体の電子伝達反応のなかで、分子内電子移動が反応の律速となっており、pHに依存していることが示唆された。電気化学測定により酵素内のPQQとヘムの酸化還元電位を決定することに成功し、本酵素の分子内電子移動機構が電位差によって制御されていることを示唆する結果を得た。
全長およびPQQドメインのみからなるタンパク質を、種々の電極上に固定化し直接電子移動型の酵素電極反応に関する知見を得た。PQQドメインのみで直接電子移動反応が可能であることを新たに見出した。タンパク質内に結合したPQQの酸化還元に由来するピーク波を観測することができ、PQQ酵素でこのような電極間と効率的な直接電子移動反応が観察された例は初めてである。
明らかにしたシトクロムドメインの構造解析を基に、変異体を作製して調べたところ、ヘム周辺の表面電荷がpHに依存したドメイン間の電子移動反応に関与することがわかり、変異によりpH依存性が変化する結果が得られたことは大変興味深い。金沢大との共同研究を遂行し、電気化学計測と高速原子間力顕微鏡(HS-AFM)の同時測定が可能な電気化学HS-AFM装置の構築をした。本手法により、酸化還元反応に伴うタンパク質一分子の動的挙動を直接観察が可能となる。

現在までの達成度 (段落)

27年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

27年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Multi-enzyme anode composed of FAD-dependent and NAD-dependent enzymes with a single ruthenium polymer mediator for biofuel cells (2015)
  • 著者名/発表者名: R. Sakuta, K. Takeda, T. Ishida, K. Igarashi, M. Samejima, N. Nakamura, H. Ohno
  • 雑誌名: Electrochemistry Communications 巻: 56 ページ: 75-78
  • DOI: 10.1016/j.elecom.2015.04.013
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Real-time dynamic adsorption processes of cytochrome c on an electrode observed through electrochemical high-speed atomic force microscopy (2015)
  • 著者名/発表者名: K. Takeda, T. Uchihashi, H. Watanabe, T. Ishida, K. Igarashi, N. Nakamura, H. Ohno
  • 雑誌名: PLoS ONE 巻: 10 号: 2 ページ: e0116685-e0116685
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0116685
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Characterization of a novel PQQ-dependent quinohemoprotein pyranose dehydrogenase from Coprinopsis cinerea classified into auxiliary activities family 12 in carbohydrate-active enzymes (2015)
  • 著者名/発表者名: K. Takeda, H. Matsumura, T. Ishida, M. Samejima, H. Ohno, M. Yoshida, K. Igarashi, N. Nakamura
  • 雑誌名: 10.1371/journal.pone.0115722 巻: 10 号: 2 ページ: e0115722-e0115722
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0115722
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] A novel pyrroloquinoline quinone-dependent 2-keto-D-glucose dehydrogenase from Pseudomonas aureofaciens (2015)
  • 著者名/発表者名: Kiwamu Umezawa, Kouta Takeda, Takuya Ishida, Naoki Sunagawa, Akiko Makave, Kazuo Isobe, Keisuke Koba, Hiroyuki Ohno, Masahiro Samejima, Nobuhumi Nakamura, Kiyohiko Igarashi, Makoto Yoshida
  • 雑誌名: Journal of Bacteriology 巻: 197(8) 号: 8 ページ: 1322-1329
  • DOI: 10.1128/jb.02376-14
  • 査読あり
• [雑誌論文] Discovery of a eukaryotic pyrroloquinoline quinone-dependent oxidoreductase belonging to a new auxiliary activity family in the database of carbohydrate-active enzymes (2014)
  • 著者名/発表者名: Hirotoshi Matsumura, Kiwamu Umezawa, Kouta Takeda, Naohisa Sugimoto, Takuya Ishida, Masahiro Samejima, Hiroyuku Ohno, Makoto Yoshida, Kiyohiko Igarashi, Nobuhumi Nakamura
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 9(8) 号: 8 ページ: e104851-e104851
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0104851
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Direct bioelectrocatalysis of PQQ-dependent pyranose dehydrogenase adsorbed on a glassy carbon electrode at various pH levels (2015)
  • 著者名/発表者名: K. Takeda, H. Matsumura, T. Ishida, M. Yoshida, K. Igarashi, M.Samejima, N. Nakamura, H. Ohno
  • 学会等名: The International Chemical Congress of Pacific Basin Societies 2015 (Pacifichem 2015)
  • 発表場所: Honolulu, Hawaii, USA
  • 年月日: 2015-12-15
  • 国際学会
• [学会発表] Direct electron transfer of a PQQ domain of pyranose dehydrogenase on Au electrodes (2015)
  • 著者名/発表者名: R. Kusuoka, K. Takeda, K. Igarashi, M. Samejima, N. Nakamura, and H. Ohno
  • 学会等名: The International Chemical Congress of Pacific Basin Societies 2015 (Pacifichem 2015)
  • 発表場所: Honolulu, Hawaii, USA
  • 年月日: 2015-12-15
  • 国際学会
• [学会発表] PQQ依存性酵素を用いたガラクツロン酸酸化触媒によるガラクタロ-1,4-ラクトン生成 (2015)
  • 著者名/発表者名: 作田陸、武田康太、大野弘幸、中村暢文
  • 学会等名: 第48回酸化反応討論会
  • 発表場所: 同志社大学寒梅館（京都府京都市上京区)
  • 年月日: 2015-10-23
• [学会発表] 担子菌から発見されたPQQ依存性ピラノース脱水素酵素の機能解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 武田康太、松村洋寿、吉田誠、五十嵐圭日子、鮫島正浩、大野弘幸、中村暢文
  • 学会等名: 第9回バイオ関連化学シンポジウム
  • 発表場所: 熊本大学工学部 黒髪南地区キャンパス（熊本県熊本市中央区）
  • 年月日: 2015-09-10
• [学会発表] 自己組織化単分子膜修飾電極上に固定したピロロキノリンキノンの電気化学的応答に金属イオンが与える影響 (2015)
  • 著者名/発表者名: 楠岡諒、武田康太、大野弘幸、中村暢文
  • 学会等名: 第9回バイオ関連化学シンポジウム
  • 発表場所: 熊本大学工学部 黒髪南地区キャンパス（熊本県熊本市中央区）
  • 年月日: 2015-09-10
• [学会発表] 自己組織化単分子膜がPQQ依存性ピラノース脱水素酵素の電子移動反応に与える影響 (2015)
  • 著者名/発表者名: 上村岳久、武田康太、五十嵐圭日子、鮫島正浩、大野弘幸、中村暢文
  • 学会等名: 第9回バイオ関連化学シンポジウム
  • 発表場所: 熊本大学工学部 黒髪南地区キャンパス（熊本県熊本市中央区）
  • 年月日: 2015-09-10
• [学会発表] Real-time dynamic adsorption processes of cytochrome c on an electrode obseved through electrochemical high-speed atomic force microscopy (2015)
  • 著者名/発表者名: K. Takeda, T. Uchihashi, H. Watanabe, T. Ishida, K. Igarashi, N. Nakamura and H. Ohno
  • 学会等名: The 1st TUAT-NCTU Joint Colloquium on Interdisciplinary Photon-nano Science
  • 発表場所: 八王子セミナーハウス（東京都八王子市）
  • 年月日: 2015-07-13
  • 国際学会
• [学会発表] 電極表面におけるタンパク質分子の動的挙動をリアルタイムで観察できる電気化学高速AFM装置の開発 (2015)
  • 著者名/発表者名: 武田康太、内橋貴之、渡辺大輝、石田卓也、五十嵐圭日子、中村暢文、大野弘幸
  • 学会等名: 第95回日本化学会春季年会
  • 発表場所: 日本大学理工学部船橋キャンパス／薬学部(千葉県船橋市)
  • 年月日: 2015-03-26 – 2015-03-29
• [学会発表] Niを導入した超好熱性古細菌由来Group Ⅲアルコール脱水素酵素の発現と機能解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 杉本親宣、武田康太、養王田正文、中村暢文、大野弘幸
  • 学会等名: 第95回日本化学会春季年会
  • 発表場所: 日本大学理工学部船橋キャンパス／薬学部(千葉県船橋市)
  • 年月日: 2015-03-26 – 2015-03-29
• [学会発表] キノヘモプロテインピラノース脱水素酵素のPQQドメインの直接電子移動反応 (2015)
  • 著者名/発表者名: 楠岡涼、武田康太、吉田誠、五十嵐圭日子、鮫島正浩、中村暢文、大野弘幸
  • 学会等名: 第95回日本化学会春季年会
  • 発表場所: 日本大学理工学部船橋キャンパス／薬学部(千葉県船橋市)
  • 年月日: 2015-03-26 – 2015-03-29
• [学会発表] NAD依存性及びFAD依存性酵素をレドックスポリマーで固定したマルチ酵素電極の作製 (2015)
  • 著者名/発表者名: 作田陸、武田康太、五十嵐圭日子、鮫島正浩、中村暢文、大野弘幸
  • 学会等名: 電気化学会第82回大会
  • 発表場所: 横浜国立大学(神奈川県横浜市)
  • 年月日: 2015-03-15 – 2015-03-17
• [学会発表] Characterization of a group Ⅲ Alcohol dehydrogenase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus horikoshii OT3 (2014)
  • 著者名/発表者名: N. Nakamura, C. Sugimoto, K. Takeda, M. Yohda, H. Ohno
  • 学会等名: 7th Asian Biological Inorganic Chemistry Conference (AsBIC7)
  • 発表場所: Gold Coast, Australia
  • 年月日: 2014-11-30 – 2014-12-05
• [学会発表] Enzymatic properties of eukaryotic pyrroloquinoline quinone-dependent sugardehydrogenase belonging to a new auxiliary activity family 12 (2014)
  • 著者名/発表者名: K. Takeda, H. Matsumura, T. Ishida, M. Samejima, H. Ohno, M. Yoshida, K. Igarashi, N. Nakamura
  • 学会等名: 7th Asian Biological Inorganic Chemistry Conference (AsBIC7)
  • 発表場所: Gold Coast, Australia
  • 年月日: 2014-11-30 – 2014-12-05
• [学会発表] 担子菌由来PQQキノヘモプロテイン糖質脱水素酵素の分子内電子移動と電極との直接電子移動 (2014)
  • 著者名/発表者名: 武田康太、吉田誠、五十嵐圭日子、鮫島正浩、中村暢文、大野弘幸
  • 学会等名: 2014年電気化学会秋季大会
  • 発表場所: 北海道大学高等教育推進機構（北海道札幌市)
  • 年月日: 2014-09-27 – 2014-09-28
• [学会発表] 超高熱性古細菌Pyrococcus horikoshii OT3由来NAD(H)依存型アルコール脱水素酵素の発現系構築とその機能解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 杉本親宣、武田康太、養王田正文、中村暢文、大野弘幸
  • 学会等名: 第8回バイオ関連化学シンポジウム
  • 発表場所: 岡山大学津島キャンパス一般教育棟(岡山県岡山市)
  • 年月日: 2014-09-11 – 2014-09-13
• [学会発表] 電気化学高速AFMによるシトクロムc分子の吸着過程のリアルタイム観察 (2014)
  • 著者名/発表者名: 武田康太、渡辺大輝、内橋貴之、石田卓也、五十嵐圭日子、中村暢文、大野弘幸
  • 学会等名: ナノ学会第12回大会
  • 発表場所: 京都大学おうばくプラザ(京都府宇治市)
  • 年月日: 2014-05-22 – 2014-05-24
• [学会発表] Real-time imaging of dynamic adsorption processes of cytochrome c on the SAM modified gold electrode by electrochemical high-speed atomic force microscopy (2014)
  • 著者名/発表者名: K. Takeda, T. Uchihashi, H. Watanabe, T. Ishida, K. Igarashi, N. Nakamura and H. Ohno
  • 学会等名: 8th International symposium on organic molecular electronics (ISOME 2014)
  • 発表場所: 東京農工大学(東京都小金井市)
  • 年月日: 2014-05-15 – 2014-05-16
• [学会発表] Construction of a flow cell-type biofuel cell to produce usefil compounds as well as electric energy (2014)
  • 著者名/発表者名: R. Sakuta, K. Takeda, K. Igarashi, M. Samejima, N. Nakamura and H. Ohno
  • 学会等名: 8th International symposium on organic molecular electronics (ISOME 2014)
  • 発表場所: 東京農工大学(東京都小金井市)
  • 年月日: 2014-05-15 – 2014-05-16
• [備考] きのこ由来新規ピロロキノリンキノン（PQQ）依存性糖酸化酵素の発見
  • URL: http://www.a.u-tokyo.ac.jp/topics/2014/20140829-1.html
• [備考] 電気刺激による生体分子を観察可能な電気化学高速ＡＦＭ装置を開発
  • URL: http://www.tuat.ac.jp/disclosure/pressrelease/2014/20150107205542/
• [備考] 電極表面でのタンパク質分子の動きを直接観察する電気化学高速原子間力顕微鏡の開発
  • URL: http://www.a.u-tokyo.ac.jp/topics/2015/20150217-1.html