| 研究課題/領域番号 |
14J08701
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| 研究種目 |
特別研究員奨励費
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 国内 |
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| 研究分野 |
生物機能・バイオプロセス
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| 研究機関 | 東京農工大学 |
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研究代表者 |
柳 昇桓 東京農工大学, 大学院工学研究院, 特別研究員(PD)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-25 – 2016-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2015年度)
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| 配分額 *注記 |
2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
2015年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
2014年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
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| キーワード | 分子クラウディング / ナノニードル / モレキュラービーコン / mRNA / 原子間力顕微鏡 / 結合速度定数 |
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| 研究実績の概要 |
まず、細胞模擬環境における固定化モレキュラービーコンに対する標的ssDNAのハイブリダイゼーション速度の解析を行った。細胞質模擬緩衝液中に1 μMの標的ssDNAを添加し、シリコンウエハーに固定されたモレキュラービーコンの蛍光強度の経時変化を評価した。その結果、時間経過に伴い蛍光強度が上昇し、10分程度で最大蛍光強度に達した。モレキュラービーコンとssDNAの結合速度定数を計算した結果、7.1×103であった。分子クラウディングの効果を調べるために、20%のPEGを添加した溶液で同様の実験を行った結果、PEGを含まない場合より5分ほど速い応答が見られたが、その最大蛍光強度は低下した。20％PEGを含む場合の結合速度定数は1.7×104であり、PEGを含まない場合と比べて2倍以上の値となった。これらの結果から、分子クラウディング環境において、モレキュラービーコンと核酸分子のハイブリダイゼーションはより速く、二重鎖構造はより不安定化することが確認された。
次に細胞質のmRNAのハイブリダイゼーションの速度解析を行った。モレキュラービーコン修飾ナノニードルをヒト子宮頸癌細胞HeLa細胞に対して細胞質に挿入し、共焦点蛍光観察によりナノニードル先端部から1 μmの領域の蛍光の経時変化を測定した。1個のHeLa細胞内にはhGAPDH mRNAが約2500分子存在することから、細胞内GAPDH mRNAの濃度を算出し、モレキュラービーコンとhGAPDH mRNA間の結合速度を求めた結果、8.1×104となった。この値は、細胞質模擬緩衝液での結果と比べて10倍以上、PEGを含む場合と比べても5倍である。GAPDH mRNA の長さがssDNAの100倍以上であること、細胞質内のGAPDH mRNA濃度が細胞質模擬実験で用いたssDNA濃度の250分の１に過ぎないことを考えると、この結果は核酸条件が細胞質の方がより不利であるにもかかわらずこのより速い拡散運動をしていることを示している。
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| 現在までの達成度 (段落) |
27年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
27年度が最終年度であるため、記入しない。
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