| 研究課題/領域番号 |
15013234
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| 研究種目 |
特定領域研究
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
生物系
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
佐甲 靖志 大阪大学, 生命機能研究科, 助教授 (20215700)
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| 研究分担者 |
村田 昌之 東京大学, 総合文化研究科, 教授 (50212254)
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| 研究期間 (年度) |
2003
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| 研究課題ステータス |
完了 (2003年度)
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| 配分額 *注記 |
4,500千円 (直接経費: 4,500千円)
2003年度: 4,500千円 (直接経費: 4,500千円)
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| キーワード | streptolysinO / 1分子計測 / 上皮成長因子 / Ras / MAP kinase / MEK / ERK |
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| 研究概要 |
細胞増殖信号を処理する細胞内分子システムEGF-Ras-MAPKシステムは、細胞増殖信号を処理する細胞内分子システムである。このシステムの内、新規遺伝子発現に至るメインストリーム、すなわちEGFと受容体の結合から、低分子量G蛋白質Rasの活性化、MAPキナーゼカスケードの情報伝達をへてERKが核移行するまでを再構成することを目的とし研究を行った。
1)セミ・インタクト細胞システムの最適化
StreptolysinO処理により調製したセミ・インタクト細胞内でEGFによるEGF受容体のリン酸化を指標として、情報伝達反応が、非処理細胞と同様に起こるような処理法の最適化をおこなった。セミ・インタクト細胞内に外来タンパク質が効率よく導入されることを確認した。
2)タイパク質発現系、標識法の確立
再構成系の要素となる各種情報伝達蛋白質を蛍光標識、精製するための発現系の構築を行った。EGF-Ras-MAPKシステムの構成要素であるMEK,ERKの蛍光蛋白質融合体の作製と培養細胞における発現の確認を行おこない、両蛍光蛋白質融合体が正常な局在と分子間相互作用を示すことが確認できた。CFP-MEK1とYFP-ERK2を共発現したHeLa細胞にEGF信号が入ると、細胞質に局在していたERKが核へ局在変化する。単独発現系ではMEKは細胞質、ERKは核内に発現し、共発現系(無刺激時)では、両蛋白質とも細胞質に局在した。これは、静止時の細胞ではERKとMEKが複合体を形成して、ERKの核移行が抑えられていることによる。セミ・インタクト系の実験でタンパク質濃度を制御するために、MEK,ERKの大腸菌発現系を構築し、MEK,YFP-ERKの精製法を確立した。
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