| 研究課題/領域番号 |
15300164
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
医用生体工学・生体材料学
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| 研究機関 | 愛媛大学 |
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研究代表者 |
田村 実 愛媛大学, 理工学研究科, 助教授 (00128349)
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| 研究分担者 |
三浦 恵 横浜市立大学, 医学部, 準教授 (60157427)
中村 洋一 大阪府立大学, 生命環境科学部, 教授 (90180413)
六反 一仁 徳島大学, 大学院・ヘルスバイオサイエンス研究部, 教授 (10230898)
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| 研究期間 (年度) |
2003 – 2005
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| 研究課題ステータス |
完了 (2005年度)
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| 配分額 *注記 |
15,200千円 (直接経費: 15,200千円)
2005年度: 2,800千円 (直接経費: 2,800千円)
2004年度: 5,300千円 (直接経費: 5,300千円)
2003年度: 7,100千円 (直接経費: 7,100千円)
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| キーワード | スーパーオキシド / 活性酸素 / NADPH oxidase / シトクロムb_<558> / 融合タンパク質 / 酸化ストレス / 細胞培養 / 分子デバイス / シトクロム b_<558> / スーパーオキサイド / NADOH oxidase / タンパク融合 / Superoxide / ROS / Cytochrome b_<558> / Fusion protein / Oxidative stress / Ex vivo study / Nano machine |
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| 研究概要 |
1.酸化ストレス実験への応用
ヒト由来の培養細胞HEK293細胞を用いてO_2^-の影響を調べた。培養液にデバイスを加えて30時間培養した。デバイスを5,000倍希釈で用いた時には細胞の増殖がとまり、500倍希釈では細胞死が起こった。また、ハムスター由来のCHO細胞はデバイスの添加で、増殖の阻害が見られたが、細胞死は見られなかった。一方、ヒト癌細胞Hela細胞は濃度にかかわらずデバイスの効果が見られなかった。これらのことから、細胞により酸化ストレスへの抵抗性にかなり差があること、また癌細胞の一種が酸化ストレスにつよいことが示された。実際に効いている活性酸素種を知るために、HEK細胞についてcatalase、SODなどの活性酸素消去剤を用いて検討した結果、直接作用している活性酸素種はH_2O_2であることが明らかになった.
3.デバイスIIの開発
先に開発したデバイスは非常に活性が高く,安定性もよく使い勝手もよかったが,ただひとつの欠点は培地中での安定性が低いことであった。そこで、この問題を解決するために、デバイスをタンパク質架橋剤で固定化することを試みた.デバイスに架橋剤EDCと反応促進剤sulfo-NHSを同時に加え,穏やかな条件下で反応させた.その結果、安定性は著しく向上し、培地(MEM)中37℃で、半減期は3.3時間となり、また5時間後もなお40%以上の活性を有する酵素を得ることに成功した.そこでこの方法で作成したデバイスを"デバイスII"と命名した.
4.再び酸化ストレス実験への応用
このデバイスIIを今回はヒト前骨髄球由来のHL60細胞に加えてO_<2->を発生させ、その影響を調べた。培養液に新デバイスを加えて培養したところ、コントロールに比べて明らかに細胞死が促進され,22時間後生きた細胞数は30%程度まで減少した.デバイスIIだけでNADPHを加えない場合にはこのような現象は見られなかった.O_<2->をH_2O_2へ変換する酵素SODを共存させた時には効果はあまり変わらなかったが,H_2O_2を水へと変換させる酵素catalaseを共存させた場合には細胞死は殆ど抑えられた.したがって,この場合も実際に作用している活性酸素種は,主にH_2O_2であると思われた。
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