低分子量GTP結合蛋白質の情報伝達反応の細胞内時空間1分子解析

• 研究課題/領域番号: 15310092
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: ナノ材料・ナノバイオサイエンス
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 佐甲 靖志 大阪大学, 生命機能研究科, 助教授 (20215700)
• 研究期間 (年度): 2003 – 2005
• 研究課題ステータス: 完了 (2005年度)
• 配分額: 13,800千円 (直接経費: 13,800千円); 2005年度: 3,300千円 (直接経費: 3,300千円); 2004年度: 3,300千円 (直接経費: 3,300千円); 2003年度: 7,200千円 (直接経費: 7,200千円)
• キーワード: Ras / 1分子計測 / Raf1 / GFP / GTP / EGF / Rho / Rac / 細胞増殖 / 細胞分化 / 神経伸長

研究概要

低分子量G蛋白質H-Rasは細胞内情報伝達のON、OFFを調節する分子スイッチとして働く重要な情報伝達分子である。Rasは細胞外刺激を契機に、結合しているGDPをGTPに交換されて活性化型となり、標的タンパク質との結合能を獲得して下流に情報を伝達すると言われている。Ras情報伝達機構の解明には生理的条件下でのRasと標的タンパク質との相互作用反応の詳細な解析が必須であるが、その相互作用は非常に弱く不安定なためにin vitroで反応の詳細を明らかにすることは難しい。我々は、生細胞観察へ1分子可視化技術を導入し、細胞内で分子間相互作用の反応速度論解析を可能にした。本研究では、細胞内でRasの標的タンパク質の一つであるRaf1の挙動を1分子可視化解析することにより、Ras、Raf1相互作用の反応ダイナミクスとキネティクスを研究し以下の結果を得た。
1)活性化型Ras(RasGTP)とRaf1の相互作用は逐次反応で、Raf1は相互作用反応中に中間状態を経由して解離する。
2)中間状態の形成には、Raf1内の2つのRas結合領域(RBDとCRD)が必要である。
3)RasとRaf1の結合状態がRas/RBDからRas/RBDCRDへと遷移する反応は中間状態の形成のための律速過程ではなく、Ras/Raf1相互作用初期過程でRasGDPとRasGTPを見分けるために使われている。
4)Ras/Raf1中間状態の形成にはS/T-キナーゼの結合やリン酸化反応が関与している。
5)Ras活性化から10分以上を経過した細胞では、活性化型RasとRaf1の相互作用部位は細胞膜の一部に局在し、特に局在の著しい部位から細胞の変形が起こる。個々のRaf1分子は恒常的に細胞質と細胞膜を循環しており、膜局在は動的平衡状態として維持されている。

研究成果

• [雑誌論文] Formation of signal transduction complexes during immobile phase of NGFR movements. (2006)
  • 著者名/発表者名: Shibata, S.C., Hibino, K., Mashimo, T., Yanagida, T., Sako,Y.
  • 雑誌名: Biochem.Biophys.Res.Comm. 342 ページ: 316-322
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Epidermal growth factor-regulated activation of Rac GTPase enhances CD44 cleavage by metalloproteinase disintegrin ADAM10 (2006)
  • 著者名/発表者名: Murai, T., Miyauchi, T., Yanagida.T., Sako, Y.
  • 雑誌名: Biochem.j. 395 ページ: 65-71
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Formation of signal transduction complexes during immobile phase of NGFR movements. (2006)
  • 著者名/発表者名: Shibata, S.C., Hibino, K., Mashimo, T., Yanagida, T., Sako, Y.
  • 雑誌名: Biochem.Biophys.Res.Comm. 342 ページ: 316-322
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Epidermal growth factor-regulated activation of Rac GTPase enhances CD44 cleavage by metalloproteinase disintegrin ADAM10 (2006)
  • 著者名/発表者名: Murai, T., Miyauchi, T., Yanagida, T., Sako, Y.
  • 雑誌名: Biochem.J. 395 ページ: 65-71
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Epidermal growth factor-regulated activation of Rac GTPase enhances CD44 cleavage by metalloproteinase disintegrin ADAM10 (2006)
  • 著者名/発表者名: Murai, T., Miyauchi, T., Yanagida.T., Sako, Y.
  • 雑誌名: Biochem.J. (in press)
• [雑誌論文] Covalent immobilization of epidermal growth factor molecule for single-molecule imaging analysis of intracellular signaling. (2006)
  • 著者名/発表者名: Ichinose, J., Morimatsu, M., Yanagida, T., Sako, Y.
  • 雑誌名: Biomaterials (in press)
• [雑誌論文] 情報伝達分子の生細胞イメージング (2005)
  • 著者名/発表者名: 岩根敦子, 上田昌宏, 日比野佳代, 佐甲靖志, 柳田敏雄
  • 雑誌名: シグナル伝達研究2005-'06(山本雅, 仙波憲太郎編 実験医学増刊) 23 ページ: 1976-1802
• [雑誌論文] Single-molecule analysis of epidermal growth factor signaling that leads to ultrasensitive calcium response. (2005)
  • 著者名/発表者名: Uyemura, T., Takagi, H., Yanagida, T., Sako, Y.
  • 雑誌名: Biophys.J. 88 ページ: 3720-3730
• [雑誌論文] Trafficking of ligand-receptor complex on the growth cones as an essential step for the uptake of nerve growth factor at the distal end of axon : a single-molecule analysis. (2005)
  • 著者名/発表者名: Tani, T., Miyamoto, Y., Fujimori, K., Sako, Y., Yanagida, T., Harada, Y.
  • 雑誌名: J.Neurosci. in press
• [雑誌論文] Engagement of CD44 promotes Rac activation and CD44 cleavage during tumor cell migration. (2004)
  • 著者名/発表者名: Murai, T., et al.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 279 ページ: 4541-4550
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Single-molecule measurement in living cells. (2004)
  • 著者名/発表者名: Ichinose, J, Sako, Y.
  • 雑誌名: Trend.Anal.Chem. 23 ページ: 587-594
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Engagement of CD44 promotes Rac activation and CD44 cleavage during tumor cell migration. (2004)
  • 著者名/発表者名: Murai, T., Miyazaki, Y., Nshinakamura, H., Sugahara, K.N., Miyauchi, T., Sako, Y., Yanagida, T., Miyasaka, M.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 279 ページ: 4541-4550
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Single-molecule measurement in living cells. (2004)
  • 著者名/発表者名: Ichinose, J., Sako, Y.
  • 雑誌名: Trends Anal.Chem. 23 ページ: 587-594
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Single-molecule measurement in living cells. (2004)
  • 著者名/発表者名: Ichinose, J., Sako, Y.
  • 雑誌名: Trend.Anal.Chem. 23 ページ: 587-594
• [雑誌論文] Single molecule observation of amplification of EGF receptor activation in semi-intact A431 cells. (2004)
  • 著者名/発表者名: Ichinose, J., Murata, M., Yanagida, T., Sako, Y.
  • 雑誌名: Bichem.Biophys.Res.Comm. 324 ページ: 1143-1149
• [雑誌論文] 1分子計測法による細胞内分子システムの解析 (2004)
  • 著者名/発表者名: 森松美紀, 佐甲靖志
  • 雑誌名: BME 18 ページ: 19-26
  • NAID: 10012920033
• [雑誌論文] Single- and multiple-molecule dynamics of the signaling from H-Ras to c-Rafl visualized on the plasma membrane of living cells. (2003)
  • 著者名/発表者名: Hibino, K., et al.
  • 雑誌名: Chem.Phys.Chem. 4 ページ: 748-753
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Single-molecule visualization in cell biology. (2003)
  • 著者名/発表者名: Sako, Y, Yanagida, T.
  • 雑誌名: Nature Rev. Mol. Cell Biol. 4
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Single-molecule visualization of cell signaling processes of epidermal growth factor receptor. (2003)
  • 著者名/発表者名: Sako, Y., et al.
  • 雑誌名: J.Pharmacol.Sci., 93 ページ: 253-258
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Single- and multiple-molecule dynamics of the signaling from H-Ras to c-Raf1 visualized on the plasma membrane of living cells. (2003)
  • 著者名/発表者名: Hibino, K., Watanabe, T., Kozuka, J., Iwane, A.H., Okada, T., Kataoka, T., Yanagida, T., Sako, Y.
  • 雑誌名: Chem.Phys.Chem. 4 ページ: 748-753
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Single-molecule visualization in cell biology. (2003)
  • 著者名/発表者名: Sako, Y., Yanagida, T.
  • 雑誌名: Nature Rev.Mol.Cell Biol. 4
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Single-molecule visualization of cell signaling processes of epidermal growth factor receptor. (2003)
  • 著者名/発表者名: Sako, Y., Ichinose, J., Morimatsu, M., Ohta, K., Uyemura, T.
  • 雑誌名: J.Pharmacol.Sci. 93 ページ: 253-258
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [図書] 細胞内蛍光1分子観察法とその応用「光科学研究の最前線」(「光科学研究の最前線」発行委員会編) (2005)
  • 著者名/発表者名: 佐甲靖志
  • 出版者: 強光子場科学研究懇談会
• [図書] 「<1分子>生物学 生命システムの新しい理解」(台原一幸、岡田康志編) (2004)
  • 著者名/発表者名: 佐甲靖志
  • 出版者: 細胞内情報処理システムを1分子計測する
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [図書] 細胞内情報処理システムを1分子計測する「<1分子>生物学 生命システムの新しい理解」(合原一幸, 岡田康志編) (2004)
  • 著者名/発表者名: 佐甲靖志
  • 出版者: 岩波書店
• [文献書誌] Hibino, K., et al.: "Single-and multiple-molecule dynamics of the signaling from H-Ras to c-Raf1 visualized on the plasma membrane of living cells"Chem.Phys.Chem.. 4. 748-753 (2003)
• [文献書誌] Sako, Y., Yanagida, T.: "Single-molecule visualization in cell biology"Nature Rev.Mol.Cell Biol.. 4. SS1-SS5 (2003)
• [文献書誌] Sako, Y., et al.: "Single-molecule visualization of cell signaling processes of epidermal growth factor receptor"J.Pharmacol.Sci.. 93. 253-258 (2003)
• [文献書誌] Murai, T., et al.: "Engagement of CD44 promotes Rac activation and CD44 cleavage during tumor cell migration"J.Biol.Chem.. 279. 4541-4550 (2004)
• [文献書誌] 佐甲靖志: "細胞内情報処理過程の1分子観察"生理学会誌. 65. 277-282 (2003)