| 研究課題/領域番号 |
15310142
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用ゲノム科学
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| 研究機関 | 大阪医科大学 |
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研究代表者 |
和田 明 大阪医科大学, 医学部, 教授 (80025387)
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| 研究分担者 |
吉田 秀司 大阪医科大学, 医学部, 講師 (60288735)
境 晶子 大阪医科大学, 医学部, 助手 (30225750)
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| 研究期間 (年度) |
2003 – 2005
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| 研究課題ステータス |
完了 (2005年度)
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| 配分額 *注記 |
14,400千円 (直接経費: 14,400千円)
2005年度: 4,700千円 (直接経費: 4,700千円)
2004年度: 4,300千円 (直接経費: 4,300千円)
2003年度: 5,400千円 (直接経費: 5,400千円)
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| キーワード | プロテオミクス / 2次元電気泳動法 / RFHR法 / IPG法 / 大腸菌 / ラット肝 / 蛋白質 / 等電点 / 定常期 / 対数期 / 質量分析 / ヒト血清 / ヒト血球 / 二次元電気泳動法 / O'Farrell法 / 等電点法 / プロテオーム解析 |
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| 研究概要 |
プロテオミクスにおいて現在最もよく普及しているのはO'Farrellが考案した等電点2次元電気泳動法にもとづくIPG法である。しかし最近、このIPG法の深刻な弱点がプロテオミクスの蛋白分離の段階に困難を齎している。一つは塩基性蛋白質の分離が不十分であること、もう一つは蛋白スポットが人為的に分裂することである。こうした弱点が等電点法の本質そのものに由来するため、これを克服するには分離原理のことなる新しい方法が必要であるが、われわれが開発したRFHR 2D PAGEは等電点法を採用せず、等速電気泳動に基づくため、この要請にこたえることが出来る。本研究の目的はRFHR法の分離能をさらに向上させ、極微量の蛋白質の検出・同定を可能にすることと、改良されたRFHR法による大腸菌と真核生物のプロテオーム解析を推進することである。
先ずRFHR法の分離能向上について
1.水冷方式の装置を考案し、厳密な温度制御を可能にした。その結果、4℃、1次元500V、2次元300Vの泳動では分離能の大幅な向上が見られ、大腸菌全蛋白質に対してIPG法の2倍を超える568の蛋白遺伝子を同定した。これはCBB染色で検出できた700スポットの80%を超える高い同定率である。分画をさらにきめ細かくすれば、極微量の蛋白質の検出・同定を実現できる。
2.0次元ゲルを廃止し、蛋白質を1次元ゲルに直接濃縮させるように0次元濃縮過程を改良した。これによって、今後装置の自動化に取り組むことが容易になった。
次いで真核生物のプロテオミクスについて
1.ラット肝プロテオミクスを進める上で、懸案である蛋白の可溶化を促進するため、2Mチオウレアの導入を試み、難溶性のより大きい蛋白質や膜結合性蛋白質の分離能を向上させた。
2.第3年度からヒトcell lineのプロテオミクスへの取り組みを開始した。引き続き取り組んでいく。
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