分子進化解析と個体NMR法を用いた糖転移酵素タンパク質機能部位の解明

• 研究課題/領域番号: 15310155
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 生物分子科学
• 研究機関: 国立遺伝学研究所
• 研究代表者: 斎藤 成也 国立遺伝学研究所, 集団遺伝研究系, 教授 (30192587)
• 研究分担者: 竹腰 清乃理 京都大学, 大学院・理学研究科, 助教授 (10206964)
• 研究期間 (年度): 2003 – 2004
• 研究課題ステータス: 完了 (2004年度)
• 配分額: 16,000千円 (直接経費: 16,000千円); 2004年度: 3,800千円 (直接経費: 3,800千円); 2003年度: 12,200千円 (直接経費: 12,200千円)
• キーワード: 糖転移酵素 / 固体NMR / 分子進化 / 大腸菌 / タンパク質立体構造

研究概要

購入したPCクラスターマシンを用いて、バクテリアの糖転移酵素遺伝子の系統解析を行った。特に、大腸菌の複数の株で変異が知られている細胞壁外の糖構造を与える糖転移酵素遺伝子群(大腸菌ゲノム中で直列に並んでいる)に着目して、それら20余のアミノ酸配列をクエリーとして相同性検索を行い、遺伝子系統樹を作成した。その結果、基質特異性の異なる数種類の糖転移酵素がひとつの相同群を形成した。これは、長い進化のあいだに、相同性を保ちながらも、一連のアミノ酸が置換することによって、基質特異性が変化していったことを示唆する。そこで、そのうちで大腸菌K12株のゲノムに存在する遺伝子waa0を選び、適切なプラスミドに挿入してそれを大腸菌に感染させ、この遺伝子の産物を大量発現させた。Hisタグを用いてカラム精製を行い、NMR解析に十分な量が得られた。固体NMR法で炭素13スペクトルを調べたところ、いくつかの明瞭なピークが観察された。特にラベルしていないので、自然界に少量存在する炭素13のシグナルを計測したことになる。さらに、このタンパク質が本当に糖転移酵素であるならば、基質となる糖が酵素表面の特定の場所に付着するはずであると考え、炭素13でラベルされたグルコースを購入し、上記と同様に作成したwaa0と混合し、凍結乾燥後に少量の水で洗浄し、固体NMR法のスペクトルを測定した。その結果、グルコースと思われる信号が検出され、waa0へのグルコースの特異的な結合を示唆することが出来た。

研究成果

• [雑誌論文] 1H to 2H Uniform Cross-Polarization Nuclear magnetic Resonance Using 2H Lee-Goldburg Irradiation in Static Powders (2005)
  • 著者名/発表者名: T.Mizuno
  • 雑誌名: J. Chem. Phys. 122 ページ: 84322-84334
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] The Evolutionary History of Glycosyltransferase Genes. (2005)
  • 著者名/発表者名: Kaneko M., Saitou N.
  • 雑誌名: Comparative glycomics and life evolution. Glycoforum(Hirabayashi J. (ed.))
  • NAID: 10012193305
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Evolution of hominoids and the search for a genetic basis for creating humanness. (2005)
  • 著者名/発表者名: Saitou N.
  • 雑誌名: Cytogenetic and Genome Research vol.108 ページ: 16-21
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] 1H to 2H Uniform Cross-Polarization Nuclear Magnetic Resonance Using 2H Lee-Goldburg Irradiation in Static Powders. (2005)
  • 著者名/発表者名: Mizuno T., Takegoshi K., Terao T.
  • 雑誌名: J. Chem. Phys. 122 ページ: 84322-84334
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] 1H to 2H Uniform Cross-Polarization Nuclear Magnetic Resonance Using 2H Lee-Goldburg Irradiation in Static Powders (2005)
  • 著者名/発表者名: T.Mizuno
  • 雑誌名: J.Chem.Phys. 122 ページ: 84322-84334
• [雑誌論文] Sequential Arrangement of γ-Valeolactone Enantiomers Enclathrated in Cholic Acids Channels as Studied by 13C Solid-State NMR : Elucidation of the Optical Resolution Mechanism (2004)
  • 著者名/発表者名: S.Nakamura
  • 雑誌名: J. Am. Chem. Socs. 126 ページ: 8766-8769
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Dynamic Nuclear Polarization by Electron Spins in the Photoexcited Triplet State : I. Attainment of Proton Polarization of 0.7 at 105 K in Naphthalene (2004)
  • 著者名/発表者名: K.Takeda
  • 雑誌名: J. Phys. Soc. Jpn. 73 ページ: 2313-2318
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Dynamic Nuclear Polarization by Electron Spins in the Photoexcited Triplet State : II. High Polarization of the Residual Protons in Deuterated Naphthale (2004)
  • 著者名/発表者名: K.Takeda
  • 雑誌名: J. Phys. Soc. Jpn. 73 ページ: 2319-2322
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Switching-angle Sample Spinning NMR Probe with a Commercially Available 20 kHz Spinning System (2004)
  • 著者名/発表者名: T.Mizuno
  • 雑誌名: J. Magn. Reson. 171 ページ: 15-19
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] 13C Nuclear Overhauser Polarization-Magic Angle Spinning (NOP-MAS) NMR Spectroscopy in uniformly 13C-labeled Solid Proteins (2004)
  • 著者名/発表者名: E.Katoh
  • 雑誌名: J. Am. Chem. Soc. 126 ページ: 3653-3657
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] DNA sequence and comparative analysis of chimpanzee chromosome 22 (2004)
  • 著者名/発表者名: The International Chimpanzee Chromosome 22 Consortium [H.Watanabe, A.Fujiyama, M.Hattori, T.D.Taylor, A.Toyoda, Y.Kuroki, H.Noguchi, A.BenKahla, H.Lehrach, R.Sudbrak, M.Kube, S.Taenzer, P.Galgoczy, M.Platzer, M.Scharfe, G.Nordsiek, H.Blocker, I.Hellmann, P.Khaitovich, S.Paabo, R.Reinhardt, H, -J.Zheng, X.-L.Zhang, G.-F.Zhu, B.-F.Wang, G.Fu, S.-X.Ren9, G.-P.Zhao, Z.Chen, Y.-S.Lee, J.-E.Cheong, S.-H.Choi, K.-M.Wu, T.-T.Liu, K.-J.Hsiao, S.-F.Tsai, C.-G.Kim, S.Oota, T.Kitano, Y.Hohara, N.Saitou, H.-S.Park, S.-Y.Wang, M.-L.Yaspo, Y.Sakaki]
  • 雑誌名: Nature vol.429 No.6990 ページ: 382-388
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Evolution of O alleles of the human ABO blood group gene. (2004)
  • 著者名/発表者名: Roubinet F., Despiau S.-P., Calafell F., Jin F., Bertanpetit J., Saitou N., Blancher A.
  • 雑誌名: Transfusion vol.44 no.5 ページ: 707-715
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Integrative annotation of 21,037 human genes validated by full-length cDNA clones. (2004)
  • 著者名/発表者名: Imanishi T., many other authors including Saitou N., Sugano S.
  • 雑誌名: PLoS Biology vol.2 issue 6 ページ: 1-20
  • NAID: 120004667172
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Human specific amino acid changes found in 103 protein coding genes. (2004)
  • 著者名/発表者名: Kitano T., Liu Y.-H., Ueda S., Saitou N.
  • 雑誌名: Molecular Biology, Evolution vol.21 no.5 ページ: 936-944
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] 13C Nuclear Overhauser Polarization-Magic Angle Spinning (NOP-MAS) NMR Spectroscopy in uniformly 13C-labeled Solid Proteins. (2004)
  • 著者名/発表者名: Katoh E., Takegoshi K., Terao T.
  • 雑誌名: J. Am. Chem. Soc. 126 ページ: 3653-3657
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Development of High-temperature and High-pressure Nuclear Magnetic Resonance Probe for Supercritical Water. (2004)
  • 著者名/発表者名: Amita F., Takegoshi.K.
  • 雑誌名: Rev. Sci. Instru. 75 ページ: 467-471
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Sequential Arrangement of γ-Valerolactone Enantiomers Enclathrated in Cholic Acids Channels as Studied by 13C Solid-State NMR: Elucidation of the Optical Resolution Mechanism. (2004)
  • 著者名/発表者名: Nakamura S., Imashiro F., Takegoshi K., Terao T.
  • 雑誌名: J. Am. Chem. Socs. 126 ページ: 8769-8766
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Dynamic Nuclear Polarization by Electron Spins in the Photoexcited Triplet State: I. Attainment of Proton Polarization of 0.7 at 105 K in Naphthalene. (2004)
  • 著者名/発表者名: Takeda K., Takegoshi K., Terao T.
  • 雑誌名: J. Phys. Soc. Jpn. 73 ページ: 2313-2318
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Dynamic Nuclear Polarization by Electron Spins in the Photoexcited Triplet State: II. High Polarization of the Residual Protons in Deuterated Naphthalene. (2004)
  • 著者名/発表者名: Takeda K., Takegoshi K., Terao T.
  • 雑誌名: J. Phys. Soc. Jpn. 73 ページ: 2319-2322
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Switching-angle Sample Spinning NMR Probe with a Commercially Available 20 kHz Spinning System. (2004)
  • 著者名/発表者名: Mizuno T., Takegoshi K., Terao T.
  • 雑誌名: J.Magn. Reson. 171 ページ: 15-19
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Sequential Arrangement of γ-Valerolactone Enantiomers Enclathrated in Cholic Acids Channels as Studied by 13C Solid-State NMR : Elucidation of the Optical Resolution Mechanism (2004)
  • 著者名/発表者名: S.Nakamura
  • 雑誌名: J.Am.Chem.Socs. 126 ページ: 8769-8766
• [雑誌論文] Dynamic Nuclear Polarization by Electron Spins in the Photoexcited Triplet State : I. Attainment of Proton Polarization of 0.7 at 105 K in Naphthalene (2004)
  • 著者名/発表者名: K.Takeda
  • 雑誌名: J.Phys.Soc.Jpn. 73 ページ: 2313-2318
• [雑誌論文] Dynamic Nuclear Polarization by Electron Spins in the Photoexcited Triplet State : II. High Polarization of the Residual Protons in Deuterated Naphthalene (2004)
  • 著者名/発表者名: K.Takeda
  • 雑誌名: J.Phys.Soc.Jpn. 73 ページ: 2319-2322
• [雑誌論文] Switching-angle Sample Spinning NMR Probe with a Commercially Available 20kHz Spinning System (2004)
  • 著者名/発表者名: T.Mizuno
  • 雑誌名: J.Magn.Reson. 171 ページ: 15-19
• [図書] ゲノムと進化 (2004)
  • 著者名/発表者名: 斎藤成也
  • 総ページ数: 210
  • 出版者: 新曜社
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Amita F.: "Development of a High-temperature and High-pressure Nuclear Magnetic Resonance Probe for Supercritical Water"Rev.Sci.Instru.. 75. 467-471 (2004)
• [文献書誌] Katoh E.: "13C Nuclear Overhauser Polarization-Magic Angle Spinning (NOP-MAS) NMR Spectroscopy in uniformly 13C-labeled Solid Proteins"J.Am.Chem.Soc.. 126. 3653-3657 (2004)
• [文献書誌] Takegoshi K.: "13C-1HDipolar-Driven 13C-13C Recoupling without 13C rf lrradiation in NMR of Rotating Solids"J.Chem.Phys.. 118. 2325-2341 (2003)