| 研究課題/領域番号 |
15350047
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
分析化学
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| 研究機関 | 熊本大学 |
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研究代表者 |
井原 敏博 熊本大学, 工学部, 助教授 (40253489)
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| 研究分担者 |
城 昭典 熊本大学, 工学部, 教授 (40038047)
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| 研究期間 (年度) |
2003 – 2005
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| 研究課題ステータス |
完了 (2005年度)
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| 配分額 *注記 |
15,100千円 (直接経費: 15,100千円)
2005年度: 3,300千円 (直接経費: 3,300千円)
2004年度: 4,700千円 (直接経費: 4,700千円)
2003年度: 7,100千円 (直接経費: 7,100千円)
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| キーワード | DNA修飾ナノスフェア / SNP解析 / 遺伝子診断 / 同時多成分解析 / 選択的凝集反応 / 免疫診断 / アレル解析 / p53遺伝子 / 光の三原色 |
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| 研究概要 |
1.修飾法の改良により、ナノスフェア表面に高効率でDNAおよびペプチドを固定化する方法を確立した。
副反応を避けるため、二段階で固定化することにした。まず、シスタミンをスフェア表面(直径40nm)に修飾してスフェア表面をチオール化した。これとは別に固定化したいDNAやペプチド末端には二価性試薬を用いてチオールと特異的に反応することが知られているマレイミドを導入した。両者を室温で混ぜることで目的とするDNA、またはペプチド修飾スフェアを高効率で調製することができた。
2.ナノスフェアの選択的凝集を利用して多色ジェノタイピングをワンポットで行うことに成功した。
p53遺伝子の一つのホットスポットを含む野生型と変異型の45量体を合成した。両サンプルDNAの末端に相補的な15量体DNAを上記1の手法により赤(R)、緑(G)、青(B)スフェアに化学修飾した。これらスフェア混合溶液に野生型DNAサンプルを添加すると全体的に黄色味(R+G)を帯びた色で発光する凝集体が、一方、変異型を添加するとマゼンタ(R+B)の凝集体が生じた。さらに両DNAの混合サンプルを添加すると白く(R+G+B)発光する凝集体を観察することができた。
3.ナノスフェアの選択的凝集を利用して多色イムノアッセイをワンポットで行うことに成功した。
上記1の手法により赤い(R)スフェアにFAKとc-Mycペプチドを、緑(G)のスフェアにはc-Mycとα-cateninペプチドを固定化した。両スフェアの混合分散溶液に対して、FAK、c-Myc、α-cateninに対する3種の抗体を添加すると、それぞれ赤(R)、黄(R+G)、緑(G)の凝集体が選択的に生成することを確認した。ワンステップの非常に簡便なイムノアッセイの可能性を示すことができた。
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