| 研究課題/領域番号 |
15370025
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
植物生理・分子
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
杉浦 昌弘 名古屋市立大学, 大学院・システム自然科学研究科, 教授 (80027044)
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| 研究分担者 |
櫻井 宣彦 名古屋市立大学, 大学院・システム自然科学研究科, 講師 (00255233)
小保方 潤一 名古屋大学, 遺伝子実験施設, 助教授 (50185667)
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| 研究期間 (年度) |
2003 – 2004
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| 研究課題ステータス |
完了 (2004年度)
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| 配分額 *注記 |
15,200千円 (直接経費: 15,200千円)
2004年度: 6,600千円 (直接経費: 6,600千円)
2003年度: 8,600千円 (直接経費: 8,600千円)
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| キーワード | RNAエディティング / mRNA / in vitro / シス配列 / トランス因子 / 蛍光標識 / タバコ / 葉緑体 / in vitro系 / 部位認識 / 非アイソトープ法 |
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| 研究概要 |
高等植物葉緑体の転写産物は、CからUへのRNAエディティングにより配列の一部が変換する。この反応はmRNA中のシチジン残基の約1000個に1個を正確に認識する必要がある。この部位認識機構の解明を目指し、以下の成果を得た。
1.葉緑体調製法の改良
RNAエディティングのトランス因子を調製するために、多量のタバコ葉よりシヨ糖ステップグレジェント遠心法で安価で短時間で調製可能となった。無傷葉緑体の検定にはドイツ側の助言を得た。
2.In Vitro RNAエディティング系の改良
以前に開発したin Vitro RNAエディティング系はP32標識mRNA基質を用いるため煩雑であった。そこで、蛍光標識による新しい活性測定法の開発に成功した。この系を用いて、タバコ葉緑体のNADH脱水素酵素サブユニットのmRNAのエディティング効率を測定した。その結果、ndh-2の30%という高い効率から活性のほとんど検出できないものまであった。このうちndh-2とndhFのエディティングのシス配列をそれぞれ10〜6ヌクレオチドの1ヶ所、ndhF mRNAでは40〜36と15〜6ヌクレオチドの2ヶ所がシス配列と同定した。シス配列が2ヶ所に分かれるのは初めての例で、エディティング機構の新しいモデルを考察した。
3.エディティング部位の認識因子の単離
In vitro活性の最も高いタバコ葉緑体psbE mRNAに対する56kDaのトランス因子を12kgのタバコ葉より調製し、ゲル電動泳動で相当バンドを切り出し、MS/MS法で部分アミノ酸配列を決定した。BLAST探索で対応する配列が見出せなかったので、タバコ固有のタンパク質と考えられる。
4.部位認識因子の同定
タバコ葉緑体ndhFとrpoBのmRNAエディティングのトランス因子をUVクロスリンク法で各々82kDaと60kDaと同定した。
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