発生工学プロテオミクスを用いたPKC-δシグナル伝達系の解明

• 研究課題/領域番号: 15370060
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 機能生物化学
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 中山 敬一 九州大学, 生体防御医学研究所, 教授 (80291508)
• 研究分担者: 畠山 鎮次 北海道大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (70294973) ; 嘉村 巧 九州大学, 生体防御医学研究所, 助教授 (40333455) ; 中山 啓子 東北大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (60294972) ; 谷内 一郎 九州大学, 生体防御医学研究所, 助手 (20284573)
• 研究期間 (年度): 2003 – 2004
• 研究課題ステータス: 完了 (2004年度)
• 配分額: 15,400千円 (直接経費: 15,400千円); 2004年度: 5,300千円 (直接経費: 5,300千円); 2003年度: 10,100千円 (直接経費: 10,100千円)
• キーワード: 発生工学 / プロテオミクス / シグナル伝達 / リン酸化 / 質量分析 / 翻訳後修飾 / PKC-δ / ノックアウトマウス

研究概要

蛋白質の生物学的機能をとらえる最も有効な手段として、発生工学的手法を用いて作製した遺伝子改変マウスの解析が挙げられる。本研究では、遺伝子改変によって生ずるマウス蛋白質の総体的な変化をプロテオミクス技術によって網羅的に検索するシステム「発生工学プロテオミクス」を構築し、それによって多くの酵素-基質関係を同定することによって種々のシグナル伝達系の総合的理解を目指した。
プロテインキナーゼC(PKC)は細胞内シグナル経路の中心的な分子としてその重要性が指摘されてきた。近年PKCファミリーの1つであるPKCδがアポトーシスの際にICE様のプロテアーゼによって切断され、活性型に変換されることが報告された。われわれはPKCδの遺伝子を人工的に破壊したマウス(PKCδノックアウトマウス;以下PKCδ-/-マウス)を作成し、そのマウスにおける発生分化や組織機能における異常を検索することにより生体内でのPKCδの生理的役害を明らかにしてきた。しかしながらノックアウトマウスにおける異常のメカニズムについてはその詳細が不明であり、発生工学プロテオミクスを用いてさらなる解析が必要であった。
発生工学プロテオミクスの前段階である定量的フォーカスド・プロテオミクスの技術について開発を行った。特に蛋白質の修飾で最も注目されているユビキチン化とリン酸化に対して、ユビキチン化プロテオーム及びリン酸化プロテオームの解析技術を確立した。さらに定量的プロテオミクス技術の確立を進めるために、培養細胞における安定同位体を用いた代謝ラベル法(SILAC)導入の検討を行った。さらに、これらの確立した技術を組み合わせて、翻訳後修飾関連プロテオームの定量解析技術を確立した。

研究成果

• [雑誌論文] Cytoplasmic ubiquitin ligase KPC regulates proteolysis of p27Kip1 at G1 phase. (2004)
  • 著者名/発表者名: Kamura, T.et al., Nakayama, K.I.
  • 雑誌名: Nature Cell Biol. 6 ページ: 1229-1235
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] VHL-box and SOCS-box domains determine binding specificity for Cul2-Rbx1 and Cul5-Rbx2 modules of ubiquitin ligases. (2004)
  • 著者名/発表者名: Kamura, T.et al.Nakayama, K.I.
  • 雑誌名: Genes Dev. 18 ページ: 3055-3065
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Skp2-mediated degradation of p27 regulates progression into mitosis. (2004)
  • 著者名/発表者名: Nakayama, K.et al., Nakayama, K.I.
  • 雑誌名: Dev.Cell 6 ページ: 661-672
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Phosphorylation-dependent degradation of c-Myc is mediated by the F-box protein Fbw7. (2004)
  • 著者名/発表者名: Yada, M.et al., Nakayama, K.I.
  • 雑誌名: EMBO J. 23 ページ: 2116-2125
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Molecular clearance of ataxin-3 is regulated by a mammalian E4. (2004)
  • 著者名/発表者名: Matsumoto, M.et al., Nakayama, K.I.
  • 雑誌名: EMBO J. 23 ページ: 659-669
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Cytoplasmic ubiquitin ligase KPC regulates proteolysis of p27^<Kip1> at G1 phase. (2004)
  • 著者名/発表者名: Kamura, T., Hara, T., Matsumoto, M., Ishida, N., Okumura, F., Hatakeyama, S., Yoshida, M., Nakayama, K., Nakayama, K.I.
  • 雑誌名: Nature Cell Biol. 6 ページ: 1229-1235
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] VHL-box and SOCS-box domains determine binding specificity for Cul2-Rbx1 and Cul5-Rbx2 modules of ubiquitin ligases. (2004)
  • 著者名/発表者名: Kamura, T., Maenaka, K., Kotoshiba, S., Matsumoto, M., Kohda, D., Conaway, R.C., Conaway, J.W., Nakayama, K.I.
  • 雑誌名: Genes Dev. 18 ページ: 3055-3065
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Skp2-mediated degradation of p27 regulates progression into mitosis. (2004)
  • 著者名/発表者名: Nakayama, K., Nagahama, H., Minamishima, Y.A., Miyake, S., Ishida, N., Hatakeyama, S., Kitagawa, M., lemura, S., Natsume, T., Nakayama, K.I.
  • 雑誌名: Dev. Cell 6 ページ: 661-672
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Phosphorylation-dependent degradation of c-Myc is mediated by the F-box protein Fbw7. (2004)
  • 著者名/発表者名: Yada, M., Hatakeyama, S., Kamura, T., Nishiyama, M., Tsunematsu, R., Imaki, H., Ishida, N., Okumura, F., Nakayama, K., Nakayama, K.I.
  • 雑誌名: EMBO J. 23 ページ: 2116-2125
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Molecular clearance of ataxin-3 is regulated by a mammalian E4. (2004)
  • 著者名/発表者名: Matsumoto, M., Yada, M., Hatakeyama, S., Ishimoto, H., Tanimura, T., Tsuji, S., Kakizuka, A., Kitagawa, M., Nakayama, K.I.
  • 雑誌名: EMBO J. 23 ページ: 659-669
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Molecular clearance of ataxin-3 is regulated by a mammalian E4. (2004)
  • 著者名/発表者名: Matsumoto, M., et al., Nakayama, K.I.
  • 雑誌名: EMBO J. 23 ページ: 659-669
• [雑誌論文] Phosphorylation-dependent degradiation of c-Myc is mediated by the F-box protein Fbw7. (2004)
  • 著者名/発表者名: Yada, M.et al., Nakayama, K.I.
  • 雑誌名: EMBO J. 23 ページ: 2116-2125
• [雑誌論文] Early embryonic death in mice lacking the β-catenin-binding protein Duplin. (2004)
  • 著者名/発表者名: Nishiyama, K.et al., Nakayama, K.I.
  • 雑誌名: Mol.Cell.Biol. 24 ページ: 8386-8394
• [雑誌論文] VHL-box and SOCS-box domains determine binding specificity for Cul2-Rbx1 and Cul5-Rbx2 modules of ubiquitin ligases. (2004)
  • 著者名/発表者名: Kamura, T.et al., Nakayama, K.I.
  • 雑誌名: Genes Dev. 18 ページ: 3055-3065
• [雑誌論文] Inherent calcineurin inhibitor FKBP38 targets Bcl-2 to mitochondria and inhibits apoptosis. (2003)
  • 著者名/発表者名: Shirane, M., Nakayama, K.I.
  • 雑誌名: Nature Cell Biol. 5 ページ: 28-37
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [図書] キーワードで理解する細胞周期イラストマップ (中山 敬一・編) (2005)
  • 著者名/発表者名: 中山 敬一
  • 総ページ数: 190
  • 出版者: 羊土社 (東京)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [図書] 決定版!プロテオーム解析マニュアル(礒辺俊明, 高橋信弘 編) (2004)
  • 著者名/発表者名: 松本雅記, 中山敬一
  • 総ページ数: 8
  • 出版者: 羊土社(東京)
• [産業財産権] 血糖調節障害の予防・治療剤,及びそれらのスクリーニング方法 (2004)
  • 発明者名: 中山 敬一 他3名
  • 権利者名: 神戸大学, 長野上智行
  • 産業財産権番号: 2004-037439
  • 出願年月日: 2004-02-13
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [産業財産権] 心筋細胞の増殖方法 (2003)
  • 発明者名: 中山 敬一 他2名
  • 権利者名: 第一サントリーファーマ株式会社
  • 産業財産権番号: 2003-391708
  • 出願年月日: 2003-11-21
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Nakayama, K., et al., Nakayama, K.I.: "Impaired degradation of inhibitory subunit of NF-κB (IκB) and β-catenin as a result of targeted disruption of the β-TrCP1 gene"Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 100(15). 8752-8757 (2003)
• [文献書誌] Kamura, T.et al., Nakayama, K.I.: "Degradation of p57^<Kip2> mediated by SCF^<SKp2>-dependent ubiquitylation"Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 100(18). 10231-10236 (2003)
• [文献書誌] Imaki, H.et al., Nakayama, K.I: "Cell cycle-dependent regulation of the Skp2 promoter by GA-binding protein"Cancer Res.. 63(15). 4607-4613 (2003)
• [文献書誌] Tsunematsu, et al., Nakayama, K.I.: "Mouse Fbw7/Sel-10/Cdc4 is required for notch degradation during vascular development"J.Biol.Chem.. 279(10). 9417-9423 (2004)
• [文献書誌] Matsumoto, M., et al.Nakayama, K.I.: "Molecular clearance of ataxin-3 is regulated by a mammalian E4"EMBO J.. 23(3). 659-669 (2004)
• [文献書誌] Ohtsuka, T., et al., Nakayama, K.I., Lee, S.W.: "ASC is a Bax adaptor and regulates the p53-Bax mitochondrial apoptosis pathway"Nature Cell Biol.. 6(2). 121-128 (2004)