| 研究課題/領域番号 |
15380072
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用生物化学
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| 研究機関 | 京都工芸繊維大学 |
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研究代表者 |
小田 耕平 京都工芸繊維大学, 繊維学部, 教授 (50081584)
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| 研究分担者 |
尾山 廣 京都工芸繊維大学, 繊維学部, 助教授 (50221700)
平賀 和三 京都工芸繊維大学, 繊維学部, 助手 (50252549)
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| 研究期間 (年度) |
2003 – 2004
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| 研究課題ステータス |
完了 (2004年度)
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| 配分額 *注記 |
12,700千円 (直接経費: 12,700千円)
2004年度: 2,800千円 (直接経費: 2,800千円)
2003年度: 9,900千円 (直接経費: 9,900千円)
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| キーワード | 致死性遺伝病 / セリン-カルボキシルプロテアーゼ / CLN2 / 新プロテアーゼファミリー / セドリシン |
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| 研究概要 |
申請者は、ズブチリシン類似の基本骨格を持ち、触媒残基がSer-Glu-Aspのcatalytic triadで構成される新規プロテアーゼファミリー、serine-carboxyl peptidase(S53)を発見した。本研究では、この内、脳変性疾患、バッテン病の発症に関与するCLN2に焦点をあて、その構造と機能を明確にすることを目的とした。
1.CLN2に保存されたSer280残基とGlu77残基の機能解析
Ser280残基のAla改変体は、酵素活性が完全に消失した。CLN2は、触媒Ser残基を修飾し、阻害活性を発現するIso-Val-Ile-Ala-Phe-Hで酵素活性が消失した。また、Glu77残基のAla改変体は、酵素活性が野生型酵素の1/10^4と著しく低下した。以上より、CLN2の触媒残基は、Ser280-Glu77-Asp81のcatalytic triadであることを生化学的に実証した。
2.CLN2のサブサイト構造解析
CLN2のサブサイトは、細菌由来酵素(S5〜S3')に比べて短く、S3〜S3'で構成されていること、また、P2位に電荷を持つアミノ酸を受容できる点やP3位にかさの小さなアミノ酸を好むことなどの特徴を明らかにした。これらの結果は、CLN2の分子モデルとも一致した。
3.CLN2の立体構造予測
Kumamolisinの立体構造を基にCLN2の分子モデルを構築した。その結果、CLN2がtripeptidyl peptiase活性、即ち、基質のアミノ末端側から3アミノ酸残基を順次切断する根拠を得ることに成功した。
4.CLN2の立体構造解析
野生型のCLN2(成熟型)をカイコ・バキュロウイルス系で多量生産し、精製酵素を得た。現在、共同研究者であるWlodawer教授(米国・国立ガン研究所・副所長)のもとで、合成阻害剤との複合体を調製し、結晶化を試みている。
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