| 研究課題/領域番号 |
15380196
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用動物科学
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| 研究機関 | 近畿大学 |
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研究代表者 |
佐伯 和弘 近畿大学, 生物理工学部, 教授 (10298937)
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| 研究分担者 |
細井 美彦 近畿大学, 生物理工学部, 教授 (70192739)
松本 和也 近畿大学, 生物理工学部, 教授 (20298938)
三谷 たすく (三谷 匡) 近畿大学, 先端技術総合研究所, 助教授 (10322265)
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| 研究期間 (年度) |
2003 – 2005
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| 研究課題ステータス |
完了 (2005年度)
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| 配分額 *注記 |
7,800千円 (直接経費: 7,800千円)
2005年度: 2,400千円 (直接経費: 2,400千円)
2004年度: 2,800千円 (直接経費: 2,800千円)
2003年度: 2,600千円 (直接経費: 2,600千円)
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| キーワード | α-リノレン酸 / ω3脂肪酸不飽和化酵素 / ウシ繊維芽細胞 / マウス3T3-L1細胞 / コドン使用頻度 / ルシフェラーゼ発現ベクター / 再構築胚 / DNAのメチル化 / ω3脂肪酸不飽和化酵素遺伝子 / ウシ初代繊維芽細胞 / stableな遺伝子導入 / 初期G1期細胞 / リポーター遺伝子発現 / Ki-67タンパク質 |
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| 研究概要 |
本研究は、哺乳動物が有さない脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を新たに導入・発現させることで、動物、特にウシの脂肪に多価不飽和脂肪酸を豊富に含有させることを目的に行った。
陸生植物で最もα-リノレン酸(18:3n-3)含量の多いアマの幼弱種子からω3脂肪酸不飽和化酵素をコードするFAD3 cDNAを取得した。これらcDNAを酵母に導入し、その脂肪酸組成を調べたところ、18:3n-3の新規生成が観察された。さらに、外来遺伝子の哺乳動物初代培養細胞への安定的導入方法を確立し、、pβ-act/FAD3/IRES/EGFP(neor)をウシ繊維芽細胞およびマウス3T3-L1細胞に導入し、機能的発現をα-リノレン酸(18:3n-3)含量で調べた。その結果、両細胞とも野生型細胞に比べ、18:3n-3比率の上昇が観察され、植物のFAD3が動物細胞内で機能することが示された。しかしながら、上昇した割合は0.4%(野生型:02%)と低いことから、FAD3塩基配列のコドン使用頻度のほ乳類型への変更を行い、CAGプロモーターを連結したベクター(pCAG/FAD3opt/IRES/EGFP(neor)を作製した。このベクターをマウス3T3-L1細胞に導入したところ、分化誘導の有無にかかわらず強発現を示した。また、すでに当ベクターを安定的に導入したウシ初代培養繊維芽細胞を得ており、脂肪酸組成を検討している。
遺伝子導入細胞を効率的に個体へ発生させるため、クローン胚の発生と胚の遺伝子発現との関係を解明した。ルシフェラーゼ発現ベクター(pβ-act/luc+/IRES/EGFP(neor))を導入したウシ繊維芽細胞による再構築胚内での遺伝子発現を調べた。その結果、細胞融合後60時間(hpf)でのLUC+発現の強度とその後の発生との関係を調べたところ、強発現した胚が胚盤胞期へ高率に発生し、すべての割球で発現した胚がさらに高率に発生し、モザイク状に発現した胚はほとんど発生せず、発現が見られない胚は全く発生しなかった。以上より、ウシ再構築胚での遺伝子発現時期、強度およびその発現状況を調べることでその後の発生が予測できることが示された。また胚のDNAのメチル化の状態を5MEC抗体で調べたところ、遺伝子発現が見られない胚は、すべての割球で発現した胚に比べ、メチル化レベルが高いことも明らかとなった。
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