| 研究課題/領域番号 |
15380221
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
環境農学
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
村上 周一郎 神戸大学, 農学部, 助教授 (00243329)
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| 研究期間 (年度) |
2003 – 2005
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| 研究課題ステータス |
完了 (2005年度)
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| 配分額 *注記 |
7,100千円 (直接経費: 7,100千円)
2005年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
2004年度: 2,300千円 (直接経費: 2,300千円)
2003年度: 3,700千円 (直接経費: 3,700千円)
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| キーワード | コールドショックタンパク質 / Rhodococcus / Sfi I / ccdB / catechol 1,2-dioxygenase / muconate cycloisomerase / muconolactone isomerase / 構成的遺伝子発現 / Sfi I メチラーゼ |
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| 研究概要 |
Rhodococcus sp.AN-22のアニリン代謝に関与する酵素において、構成的に発現するカテコール1,2-ジオキシゲナーゼ、cis,cis-ムコン酸サイクロイソメラーゼ、およびムコノラクトンイソメラーゼ遺伝子をクローニングし、これらを転写するプロモーター領域を明らかにした。また本菌のコールドショックタンパク質をコードするcspAおよびcspB2遺伝子をクローニングし、cspB1遺伝子を含むこれらの遺伝子のプロモーター領域を明らかにした。
次にRhodococcus sp.AN-22の形質転換法を最適化し、従来の方法と比較して、15倍形質転換効率を高めることに成功した。
決定したcspB1遺伝子のプロモーター領域の下流に、転写因子GATA-1(致死性ペプチド)をコードする遺伝子やDNA gyrase活性を阻害するタンパク質をコードするccdB遺伝子を連結した低温致死カセットを構築した。これらの低温致死カセットを本菌に導入した後、低温条件での致死性の発現を調べたところ、親株は15℃で生育したのに対し、構築したカセットを導入した形質転換株は生育を示さなかった。しかしその後、生育温度を30℃にシフトさせた場合、菌の生育が見られたことから、発現した転写因子GATA-1やccdB遺伝子産物は本菌を死滅させたのではなく、生育を抑制したのみであることが明らかになった。
さらに強力な致死遺伝子を含む低温致死カセットを構築する目的で、制限酵素Sfi Iをコードする遺伝子をクローニングすることを試みた。同遺伝子をクローニングし、得られた断片の塩基配列を調べたところ、いずれのクローンも完全な目的遺伝子を含んでいなかった。この結果は、完全なSfi I遺伝子を有する形質転換株では、同遺伝子のわずかな発現によって大腸菌のゲノムが消化され、死滅することによると結論した。
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