| 研究課題/領域番号 |
15390068
|
|---|
| 研究種目 |
基盤研究(B)
|
| 配分区分 | 補助金 |
|---|
| 応募区分 | 一般 |
|---|
| 研究分野 |
環境生理学(含体力医学・栄養生理学)
|
|---|
| 研究機関 | 北海道大学 |
|---|
研究代表者 |
本間 さと 北海道大学, 大学院・医学研究科, 助教授 (20142713)
|
|---|
| 研究分担者 |
白川 哲夫 北海道大学, 病院・助教授 (00187527)
近江谷 克裕 (近江谷 克祐) 独立行政法人, 産業技術総合研究所・セルエンジニアリング研究部門, グループ長(研究職) (20223951)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2003 – 2004
|
| 研究課題ステータス |
完了 (2004年度)
|
| 配分額 *注記 |
15,400千円 (直接経費: 15,400千円)
2004年度: 5,800千円 (直接経費: 5,800千円)
2003年度: 9,600千円 (直接経費: 9,600千円)
|
|---|
| キーワード | 生物時計 / サーカディアンリズム / 時計遺伝子 / 生物発光 / 視交叉上核 / トランスジェニックマウス / カルシウムイメージング / 転写調節 |
|---|
| 研究概要 |
本研究は、レポーター遺伝子技術の応用により、複数の遺伝子発現を同時に測定解析し、細胞内における時計遺伝子多重連動分子フィードバックループを検証して、生物時計の発振メカニズムに迫ることを目的として行われた。
1.生物発光酵素をレポーターとした2時計遺伝子発現リアルタイムモニタリング:時計遺伝子Per1とBmal1プロモーター下流にそれぞれ分泌型ウミボタルルシフェラーゼ(VL)と非分泌型ホタルルシフェラーゼ(FL)cDNAを挿入したベクターを構築し、トランスジェニック(Tg)マウスを作成して両遺伝子発現の連続測定を行った。VLは組織特異性が高く、発現が一部の臓器に限られたが、灌流培養により2遺伝子同時モニタリングを初めて成功させた。また様々な末梢臓器におけるBmal1発現リズムを測定し、多くの臓器・組織が自律振動を示すこと、その周期位相は視交叉上核のそれと乖離しうること、細胞間同期機構が存在することを明らかにした。
2.細胞内Ca^<2+>レベルと時計遺伝子発現の同時モニタリング:Ca^<2+>結合蛍光蛋白CameleonをNSEプロモーター支配下に発現させ、SCN培養スライスにおけるFRET法による細胞内Ca^<2+>レベルと時計遺伝子発現の同時測定を試みた。その結果、細胞内Ca^<2+>と時計遺伝子は共にサーカディアン変動を示すことが分かった。また、時計遺伝子はグリア細胞においても神経と同期したリズムを示すことが分かった
3.赤色発光FLによる時計遺伝子発現測定:同一基質による複数遺伝子発現の連続モニタリングのため、発光波長が細胞内pHに依存しない赤、緑またはオレンジに極大発光波長をもつルシフェラーゼをBmal1プロモーター下流に挿入して波長特性を解析した。さらに赤色FL Tgマウスを作成し、同一細胞からの複数遺伝子同時モニタリングに道を開いた。
|
