| 研究課題/領域番号 |
15390094
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
医化学一般
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
菊池 章 広島大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 教授 (10204827)
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| 研究分担者 |
岸田 昭世 広島大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 助教授 (50274064)
山本 英樹 広島大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 助手 (20372691)
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| 研究期間 (年度) |
2003 – 2004
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| 研究課題ステータス |
完了 (2004年度)
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| 配分額 *注記 |
15,400千円 (直接経費: 15,400千円)
2004年度: 5,100千円 (直接経費: 5,100千円)
2003年度: 10,300千円 (直接経費: 10,300千円)
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| キーワード | Wnt / エンドサイトーシス / Rho-キナーゼ / conditioned medium / 脂質修飾 / 糖質修飾 / β-カテニン / Frizzled / LRP / ダイナミン / 受容体 / Rhoキナーゼ / PC12細胞 |
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| 研究概要 |
Wntとその受容体のエンドサイトーシスの分子機構を明らかにすると共に受容体エンドサイトーシスとWntシグナル伝達経路の活性制御との関連を明らかにすることを目的として、下記の成果を得た。
(1)conditioned medium 1Lから約40〜60μgのWnt-3aとWnt-5aを単一蛋白質として精製できるようになった。精製Wnt-3aは種々の培養細胞においてβ-カテニンの蓄積を誘導した。また、精製Wnt-3aはPC12細胞においてRho-キナーゼを活性化した。さらに、NGFによる神経突起伸長をWnt-3aはRho-キナーゼを活性化することにより抑制した。精製Wnt-5aはWnt-3a依存性のTcf活性化を抑制したが、β-カテニンの安定化には影響しなかった。この抑制作用には蛋白質リン酸化酵素NLKが関与していた。Wnt-11を含むconditioned mediumの作製にも成功してWnt-11蛋白質の精製が可能になった。
(2)Wnt-3aとWnt-5a共に脂質修飾と糖質修飾を受けており、糖質修飾はWnt-3aとWnt-5aの分泌と脂質修飾に必要であるが、分泌後はその作用に必要ではないことが明らかになった。脂質修飾はWnt-3aとWnt-5aの分泌に必須ではなかった。
(3)Wnt-3aは受容体のFrizzled 5とLRP6のエンドサイトーシスを誘導した。細胞膜上に存在したFrizzled 5とLRP6はWnt-3a刺激により、30分〜60分で細胞質に認められ、180分経つと再び細胞膜上に出現した。アドレナリン受容体刺激によるエンドサイトーシスを抑制するダイナミンK44AはWnt-3a依存性のβ-カテニンの蓄積を抑制した。また、クラスリンまたはカベオリンをRNAi法によりノックダウンすると、Wnt-3a依存性のβ-カテニンの蓄積が抑制された。すなわち、Wnt-3a依存性の受容体のエンドサイトーシスにはクラスリンまたはカベオリン依存性の経路があり、両経路ともβ-カテニンの安定化に重要であることが明らかになった。
以上の結果から、本研究課題の計画の遂行はほぼ予定通りだったと判断している。本研究課題により確立されたWnt受容体のエンドサイトーシスの実験系を用いて、どのリガンドがどの細胞でどのWntシグナル経路を活性化するかを明らかにすることが今後の重要な課題であろう。
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