Notchによる軟骨細胞・骨芽細胞分化振り分けの分子機構の研究

• 研究課題/領域番号: 15390557
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 形態系基礎歯科学
• 研究機関: 東京理科大学
• 研究代表者: 穂積 信道 東京理科大学, 生命科学研究所, 教授 (60051744)
• 研究分担者: 鈴木 光浩 東京理科大学, 助手 (00321662) ; 守村 直子 独立行政法人理化学研究所, 比較神経発生研究チーム, 研究員 (00349044) ; 香山 雅子 東京理科大学, 生命科学研究所, 助手 (80318229)
• 研究期間 (年度): 2003 – 2005
• 研究課題ステータス: 完了 (2005年度)
• 配分額: 11,800千円 (直接経費: 11,800千円); 2005年度: 3,000千円 (直接経費: 3,000千円); 2004年度: 4,400千円 (直接経費: 4,400千円); 2003年度: 4,400千円 (直接経費: 4,400千円)
• キーワード: Notch / Limb bud micro-mass culture / SST-REX method / ATDC5 / 軟骨形成 / 骨形成 / Limb Bud Micromass Culture / DAPT / マウス肢芽 / 間葉系幹細胞 / 細胞凝集 / 内軟骨性骨化 / 遺伝子発現 / 転写因子 / Conditional deletion mutantマウス / Notch1 / 軟骨基質 / 骨芽細胞

研究概要

我々の骨格の大部分を占める長管骨は軟骨内骨化により骨形成がおこる。未分化間葉系細胞が骨形成予定領域で凝集し、軟骨細胞が分化し最終的には骨芽細胞による骨形成により置き換えられる。我々は形態形成分子、Notch1、が軟骨細胞の分化を抑制するが骨芽細胞の分化を促進することを見出した。本研究はNotch1が軟骨細胞と骨芽細胞の分化を制御する、メカニズムを解明する目的で行った。
骨形成においては軟骨形成が先行する。このように骨形成のメカニズムの解明には軟骨細胞の分化のメカニズムを確立する必要がある。そこで胎生マウスを用いて間様系細胞凝集領域にNotch1発現を検索した。胎生マウスにNotch1の発現を確認し、軟骨様細胞株、ATDC5、使用して、さらに詳しい解析を行った。コンフルエントに達したATDC5にインスリンを加えると細胞凝集がおこり軟骨細胞に分化する。軟骨細胞分化を誘導した細胞にアデノウイルスベクターで活性型Notch1を導入すると、軟骨細胞分化抑制が確認された。他の軟骨基質をコードする遺伝子の発現も抑制された。さらに胎生12.5日のマウス肢芽からLimb bud micro-mass culture(LBMC)を作製し実験を行なった。この培養系では、未分化間葉系幹細胞が凝集し結節を形成する。さらにこの結節からは軟骨細胞が分化する。LBMCにアデノウイルスベクターで活性型Notch1を導入すると細胞凝集と軟骨細胞分化が抑制された。γ-セクレターゼ阻害剤であるDAPTを添加すると軟骨細胞分化抑制は解除された。Notch1シグナリングは細胞凝集と細胞結節形成による形態形成を制御することが分かった。Notch遺伝子ノックアウトマウスは胎生致死にいたるので、骨形成の研究が困難である。この問題を解決するために我々はNotchr1遺伝子のConditional delection mutantマウスを作製する実験を行なった。軟骨細胞特異的に発現するコラーゲンXIプロモーターにCreリコンビナーゼ遺伝子を繋ぎCol XI/creマウスを作製した。このマウスではCreリコンビナーゼ遺伝子が軟骨形成特異的に発現することを確認した。このマウスラインは骨形成の分子機構の研究に大きなインパクトを与えるものと期待される。さらに軟骨細胞分化特異的に発現する遺伝子をSignal sequence trap by retrovirus-mediated expression(SST-REX)法を用いてクローニングした。この実験により4つの未同定の遺伝子をクローンすることができた。現在、これらの遺伝子を解析している。

研究成果

• [雑誌論文] Use of the SST-REX method for identification of genes espressed at the condensation stage of chondrogenic cell line ATDC5 (2006)
  • 著者名/発表者名: Noguchi A, et al.
  • 雑誌名: J.Bone Miner.Metab. 24 ページ: 153-157
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Site-specific DNA methylation by a complex of PU.I and Dumt3a/b (2006)
  • 著者名/発表者名: Suzuki M, et al.
  • 雑誌名: Oncogene 25 ページ: 2477-2488
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Involvement of Notch signaling in initiation of prechondrogenic condensation and formation of nodules in limb bud micromass culture (2006)
  • 著者名/発表者名: Fujimaki R, et al.
  • 雑誌名: J.Bone Miner.Metab. 24 ページ: 191-198
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] use of the SST-REX method for the identification of genes expressed at the condensation, stage of chondrogenic cell line ATDC5 (2006)
  • 著者名/発表者名: Noguchi, A., Watanabe, N., Fujimaki, R., Kitamura, T., Hayashizaki, Y., Miyaki, S., Tezuka, K., Hozumi, N.
  • 雑誌名: J.Bone Miner.Metab. 24 ページ: 153-157
  • NAID: 10018194449
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Site specific DNA methylatlion by a complex of PU.1 and Dnmt3a/b (2006)
  • 著者名/発表者名: Suzuki, M., Yamada, F., Kihara-Negishi, F., Sakurai, T., Hara, E., Tenen, D.G., Hozumi, N., Oikawa, T.
  • 雑誌名: Oncogene 25 ページ: 2477-2488
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Involvement of Notch signaling in initiation of prechondrogenic condensation and formation of nodules in limb bud micromass cultures (2006)
  • 著者名/発表者名: Fujimaki, R., Toyama, Y., Hozumi, N., Tezuka, K.
  • 雑誌名: J.Bone Miner.Metab. 24 ページ: 191-198
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Site-specific DNA methlation by a comples of PU.1 and Dnmt3a/b (2006)
  • 著者名/発表者名: Suzuki, M., et al.
  • 雑誌名: Oncogene (in press)
• [雑誌論文] Involvement of Notch signaling in initiation of prech ondrogenic condensation and formation of nodules in limb bud micromass cultures (2006)
  • 著者名/発表者名: Fujimaki, R., et al.
  • 雑誌名: J.Bone Miner.Metab. (in press)
• [雑誌論文] Expression of Cre rcombinase in the mouse developing chondrocytes driven by the mouse a2(XI)collagen promoter (2005)
  • 著者名/発表者名: Fujimaki R, et al.
  • 雑誌名: J.Bone Miner.Metab. 90 ページ: 270-273
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Expression of Cre recombinase in the mouse developing chondrocytes driven by the mouse a2(XI) collagen promoter. (2005)
  • 著者名/発表者名: Fujimak, R., Hayashi, K., Watanabe, N., Yamada, T., Toyama, Y., Tezuka, K., Hozumi, N.
  • 雑誌名: J.Bone Miner.Metab. 23 ページ: 270-273
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Expression of Cre recombinase in the mouse developing chondrocytes driven by the mouse α2 (XI) collagen promoter (2005)
  • 著者名/発表者名: Fujimaki, R., et al.
  • 雑誌名: J.Bone Miner.Metab. 23 ページ: 270-273
• [雑誌論文] Dual regulation of BCR-mediated growth inhibition signaling by CD72 (2005)
  • 著者名/発表者名: Baba, T., et al.
  • 雑誌名: Eur.J.Immunol. 35 ページ: 1634-1642
• [雑誌論文] 1'-acetoxychavicol acetate is a novel nuclear factor κB inhibitor with significant activity against multiple myeloma in vitro and in vivo (2005)
  • 著者名/発表者名: Ito, K., et al.
  • 雑誌名: Cancer Res. 65 ページ: 4417-4424
• [雑誌論文] Use of the SST-REX method for the identification of genes expressed at the condensation stage of chondrogenic cell line ATDC5 (2005)
  • 著者名/発表者名: Noguchi, A., et al.
  • 雑誌名: J.Bone Miner.Metab. 24 ページ: 153-157
• [雑誌論文] Expression of Cre recombinase in the mouse developing chondrocytes driven by the mouse α2(XI) collagen promoter (2005)
  • 著者名/発表者名: Fujimaki, R.et al.
  • 雑誌名: J.Bone Miner.Metab. (in press)
• [雑誌論文] Inducible costimulator-dependent IL-10 production by regulatory Tcells specific for self-antigen (2004)
  • 著者名/発表者名: Kohyama M, et al.
  • 雑誌名: Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101 ページ: 4192-4197
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Inducible costimulator-dependent IL-10 production by regulatory T cells specific for self-antigen. (2004)
  • 著者名/発表者名: Kohyama, M., Sugahara, D., Sugiyama, S., Yagita, H., Okumura, K., Hozumi, N.
  • 雑誌名: Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101 ページ: 4192-4197
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Tumor angiogenesis in the bone marrow of multiple myeloma patients and its alteration by thalidomide treatment (2004)
  • 著者名/発表者名: Du, W.et al.
  • 雑誌名: Pathol Int. 54 ページ: 285-294
• [雑誌論文] Hepatitis C virus infection in human liver tissue engrafted in mice with an infectious molecular clone (2004)
  • 著者名/発表者名: Maeda, N.et al.
  • 雑誌名: Liver Int. 24 ページ: 259-267
• [雑誌論文] Suooerssion of differentiation and proliferation of early chondrogenic cells by Notch (2003)
  • 著者名/発表者名: Watanebe N, et a;
  • 雑誌名: J.Bone Miner.Metab. 21 ページ: 344-352
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Suppression of differentiation and proliferation of early chondrogenic cells by Notch. (2003)
  • 著者名/発表者名: Watanabe, N., Tezuka, Y., Matsuno, K., Miyatani, S., Morimura, N., Yasuda, M., Fujimaki, R., Kuroda, K., Hiraki, Y., Hozumi, N., Tezuka, K.
  • 雑誌名: J.Bone Miner.Metab. 21 ページ: 344-352
  • NAID: 10014445248
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [図書] Recent development in Immunology(分担執筆) (2004)
  • 著者名/発表者名: Hozumi, N., Kohyama, M.
  • 総ページ数: 371
  • 出版者: Research Signpost
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Watanabe, N., Tezuka, Y.et al.: "Suppression of differentiation and proliferation of early chondrogenic cells By Notch"J.Bone Miner.Metab.. 21. 344-352 (2003)
• [文献書誌] Baba, T., Fusaki, N.et al.: "Myosin is an in vivo substrate of the protein tyrosine phospatase (SHP-1) after mlgM cross-linking"Biochem.Biophys.Res.Comm.. 304. 67-72 (2003)
• [文献書誌] Kohyama, M., Sugahara, D.et al.: "Inducible costimulator-dependent IL-10 production by regulatory T cells specific for self-antigen"Proc.Natl.Acad.Sci.USA. (in press). (2004)