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生細胞内におけるPKNの活性化機序および標的因子との相互作用を明らかにする

研究課題

研究課題/領域番号 15510175
研究種目

基盤研究(C)

配分区分補助金
応募区分一般
研究分野 生物分子科学
研究機関神戸大学

研究代表者

向井 秀幸  神戸大学, バイオシグナル研究センター, 助教授 (80252758)

研究期間 (年度) 2003 – 2004
研究課題ステータス 完了 (2004年度)
配分額 *注記
3,400千円 (直接経費: 3,400千円)
2004年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
2003年度: 2,400千円 (直接経費: 2,400千円)
キーワードPKN1 / RhoA / RhoB / protein kinase / FRET / kinase activity / CFP / YFP / substrate specificity / CKAR / NKAR
研究概要

1.PKNの活性化をPKNの立体構造変化をもとにモニターするプローブ(NCOP)の構築。
(1)PKN1の1分子内にCFPとYFPを含む種々の動物細胞発現ベクターを作成した。
(2)(1)のベクターを、培養細胞に発現させ、蛍光分光光度計によりYFP/CFPによるFRETがみとめられる構築を同定した。FRET値は、PKN1のin vitroにおける活性化剤として知られる不飽和脂肪酸や低濃度の界面活性剤などの存在下で、濃度依存的に低下することを見出した。
(3)(2)のベクターを種々の細胞に導入したところ、内因性のPKN1の局在と同様、細胞質にびまん性の蛋白発現が認められたが、活性型もしくは野生型のRhoBと共発現することにより、核近傍膜構造や、形質膜への移行がみとめられた。RhoBとの共発現時に、NCOPのFRET値が変化するかどうか検討したが、有意な変化は認められなかったことから、RhoBとの結合のみでは、PKN1のコンフォメーションに活性化の変化を与えるのには十分ではない可能性も示唆された。
2.PKNの活性化を基質のりん酸化をもとにモニターするプローブ(NKAR)の作成。
(1)ビオチンタグをつけたコンビナトリアルペプチドライブラリーを用いて、in vitroで精製PKNによるリン酸化反応を行い、特異的リン酸化モチーフの解析をおこなったところ、PKCと非常によく似たモチーフが得られた。そのわずかな違いをもとに種々の合成ペプチドをデザインし、実際にin vitroでのリン酸化レベルを検討することにより、PKC特異的にリン酸化されるペプチドモチーフを決定することに成功した。しかしながら、現在までのところ、PKN特異的なモチーフの決定には至っていない。今後解析を重ね、粗精製フラクションでのリン酸化アッセイを可能にする特異的ペプチドのモチーフを決定し、継続してNKARの作製をトライしたい。

報告書

(3件)
  • 2004 実績報告書   研究成果報告書概要
  • 2003 実績報告書
  • 研究成果

    (18件)

すべて 2005 2004 2003 その他

すべて 雑誌論文 (14件) 図書 (2件) 産業財産権 (1件) 文献書誌 (1件)

  • [雑誌論文] Centrosome-targeting region of CG-NAP causes centrosome amplification by recruiting cyclin E-cdk2 complex.2005

    • 著者名/発表者名
      Nishimura T
    • 雑誌名

      Genes Cells.2005 10

      ページ: 75-86

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2004 研究成果報告書概要
  • [雑誌論文] The role of the regulatory subunit of fission yeast calcineurin for in vivo activity and its relevance to FK506 sensitivity2005

    • 著者名/発表者名
      Sio SO
    • 雑誌名

      J.Biol.Chem. 280

      ページ: 12231-12238

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2004 研究成果報告書概要
  • [雑誌論文] Involvement of protein kinase PKN1 in G(2)/M delay caused by arsenite.2005

    • 著者名/発表者名
      Isagawa T
    • 雑誌名

      Mol.Carcinog. 43

      ページ: 1-12

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2004 研究成果報告書概要
  • [雑誌論文] Centrosome-targeting region of CG-NAP causes centrosome amplification by recruiting cyclin E-cdk2 complex.2005

    • 著者名/発表者名
      Nishimura T, Takahashi M, Kim HS, Mukai H, Ono Y
    • 雑誌名

      Genes Cells. 10(1)

      ページ: 75-86

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2004 研究成果報告書概要
  • [雑誌論文] The role of the regulatory subunit of fission yeast calcineurin for in vivo activity and its relevance to FK506 sensitivity.2005

    • 著者名/発表者名
      Sio SO, Suehiro T, Sugiura R, Takeuchi M, Mukai H, Kuno T
    • 雑誌名

      J Biol Chem. 280(13)

      ページ: 12231-12238

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2004 研究成果報告書概要
  • [雑誌論文] Involvement of protein kinase PKN1 in G(2)/M delay caused by arsenite.2005

    • 著者名/発表者名
      Isagawa T, Takahashi M, Kato T Jr, Mukai H, Ono Y
    • 雑誌名

      Mol Carcinog. 43(1)

      ページ: 1-12

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2004 研究成果報告書概要
  • [雑誌論文] Purification and Kinase assay of PKN2005

    • 著者名/発表者名
      Mukai, H., Ono, Y
    • 雑誌名

      Methods in Enzymology, Small GTPases(Elsevier) (in press)

    • NAID

      120000946410

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2004 研究成果報告書概要
  • [雑誌論文] Centrosome-targeting region of CG-NAP causes centrosome amplification by recruiting cyclin E-cdk2 complex.2005

    • 著者名/発表者名
      Tamako Nishimura
    • 雑誌名

      Genes Cells.2005 第10巻・第1号

      ページ: 75-86

    • 関連する報告書
      2004 実績報告書
  • [雑誌論文] Protein kinase PKN1 associates with TRAF2 and is involved in TRAF2-NF-kappaB signaling pathway.2004

    • 著者名/発表者名
      Gotoh Y
    • 雑誌名

      Biochem.Biophys.Res.Commun. 314

      ページ: 688-694

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2004 研究成果報告書概要
  • [雑誌論文] Lbc proto-oncogene product binds to and could be negatively regulated by metastasis suppressor nm23-H2.2004

    • 著者名/発表者名
      Iwashita S
    • 雑誌名

      Biochem.Biophys.Res.Commun. 320

      ページ: 1063-1068

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2004 研究成果報告書概要
  • [雑誌論文] Protein kinase PKN1 associates with TRAF2 and is involved in TRAF2-NF-kappaB signaling pathway.2004

    • 著者名/発表者名
      Gotoh Y, Oishi K, Shibata H, Yamagiwa A, Isagawa T, Nishimura T, Goyama E, Takahashi M, Mukai H, Ono Y
    • 雑誌名

      Biochem Biophys Res Commun. 314(3)

      ページ: 688-694

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2004 研究成果報告書概要
  • [雑誌論文] Lbc proto-oncogene product binds to and could be negatively regulated by metastasis suppressor nm23-H2.2004

    • 著者名/発表者名
      Iwashita S, Fujii M, Mukai H, Ono Y, Miyamoto M
    • 雑誌名

      Biochem Biophys Res Commun. 320(4)

      ページ: 1063-1068

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2004 研究成果報告書概要
  • [雑誌論文] Lbc proto-oncogene product binds to and could be negatively regulated by metastasis suppressor nm23-H2.2004

    • 著者名/発表者名
      Shinki Iwashita
    • 雑誌名

      Biochem Biophys Res Commun. 第320巻・第4号

      ページ: 1063-1068

    • 関連する報告書
      2004 実績報告書
  • [雑誌論文] Expression and purification of protein kinase C from insect cells2003

    • 著者名/発表者名
      Mukai, H., Ono, Y
    • 雑誌名

      Methods Mol.Biol., Protein Kinase C Protocols)(Totowa, NJ)(Humana Press Inc.) 233

      ページ: 21-34

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2004 研究成果報告書概要
  • [図書] Methods in Enzymology2005

    • 著者名/発表者名
      Mukai H
    • 出版者
      Elsevier (in press)
    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2004 研究成果報告書概要
  • [図書] Protein Kinase C Protocols, Methods Mol.Biol.2003

    • 著者名/発表者名
      Mukai H
    • 総ページ数
      14
    • 出版者
      Humana Press
    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2004 研究成果報告書概要
  • [産業財産権] PKN1ノックアウト動物、および向精神薬開発法2005

    • 発明者名
      向井 秀幸
    • 権利者名
      向井 秀幸
    • 産業財産権番号
      2005-057600
    • 出願年月日
      2005-03-02
    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2004 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Gotoh Y: "Protein kinase PKN1 associates with TRAF2 and is involved in TRAF2-NF-kappaB signaling pathway"Biochem Biophys Res Commun.. 314(3). 688-694 (2004)

    • 関連する報告書
      2003 実績報告書

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公開日: 2003-04-01   更新日: 2016-04-21  

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