| 研究課題/領域番号 |
15570094
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
構造生物化学
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| 研究機関 | 旭川医科大学 |
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研究代表者 |
竹内 昌之 (2005) 旭川医科大学, 医学部, 助手 (40226999)
石田 敦彦 (2003-2004) 旭川医科大学, 医学部, 助手 (90212886)
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| 研究分担者 |
加藤 剛志 旭川医科大学, 医学部, 助教授 (60194833)
谷口 隆信 旭川医科大学, 医学部, 教授 (60217130)
茂里 康 産業技術総合研究所, 人間系特別研究体, 主任研究員 (90357187)
亀下 勇 香川大学, 農学部, 教授 (60127941)
竹内 昌之 旭川医科大学, 医学部, 助手 (40226999)
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| 研究期間 (年度) |
2003 – 2005
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| 研究課題ステータス |
完了 (2005年度)
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| 配分額 *注記 |
3,700千円 (直接経費: 3,700千円)
2005年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
2004年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
2003年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
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| キーワード | CaMキナーゼ / プロテインホスファターゼ / 脱リン酸化 / CaMキナーゼIV / ゼブラフィッシュ / アンチセンスRNA / ノックダウン / 胚発生 / アポトーシス / GAPDH / 結合タンパク質 / 相互作用解析 / ファーウエスタンブロッティング / 抗体 |
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| 研究概要 |
CaMKPの活性とその調節機構を調べる為に、組換え体CaMKPの変異体を作製し、その解析を行なった。N末端側の配列は活性のある酵素の形成に必須である事、ポリグルタミン酸クラスターはポリカチオンによる活性化に関与している事、そして、PPMファミリーで保存されているアミノ酸残基がCaMKPの活性に重要である事を明らかにした。
CaMKPと共にグループを形成しているCaMKP-Nについて、組織における細胞内局在について解析した。ラットの脳の細胞分画を行ない、得られた画分をウエスタンブロットにより解析した。ほとんどのCaMKP-NはC末端側が欠失しており、細胞質に存在している事が示された。ラットの脳の免疫組織化学による解析により、大部分の神経細胞では細胞質に存在し、一部の神経細胞で核に存在している事が示された。従って、CaMKP-Nは核に存在するCaMキナーゼのみならず、細胞質のCaMキナーゼをも調節している可能性が示唆された。
アンチセンス法により、ゼブラフィッシュ胚におけるCaMKP-Nのノックダウン実験をおこない、その発生過程を観察したところ、アンチセンスRNAを注入した胚では脳細胞の異常なアポトーシスが起こり、頭部や脊髄の著明な発生異常が認められた。この結果から胚発生の過程においてCaMKP-Nが重要な役割を担っていることが示唆された。
CaMKPをプローブに用いた二次元ファーウエスタンブロッティング法により、ラット脳におけるCaMKP結合タンパク質を検索・同定し、glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)をCaMKP結合タンパク質として同定した。GST-プルダウンアッセイによってGAPDHはこれまで機能未知であったCaMKPのN末領域と相互作用していることが判明した。
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