| 研究課題/領域番号 |
15570095
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
構造生物化学
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
佐藤 孝雄 東京工業大学, 大学院・生命理工学研究科, 助手 (80243731)
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| 研究期間 (年度) |
2003 – 2005
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| 研究課題ステータス |
完了 (2005年度)
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| 配分額 *注記 |
3,700千円 (直接経費: 3,700千円)
2005年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
2004年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
2003年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
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| キーワード | プロリルエンドベプチダーゼ / 自動分注器 / 溶解度曲線 / 多変量解析 / X線結晶構造解析 / ホモロジーモデリング / ドッキング・シミュレーシ / 分子軌道法 / プロリルエンドペプチダーゼ / ドッキング・シミュレーション / 沈殿曲線 / 分子軌道計算法 / ストリーク・シーディング / 分子置換法 / 阻害剤-酵素複合体 |
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| 研究概要 |
プロリルエンドペプチダーゼ(PEPase)は、プロリン残基のC末端側を特異的に切断する酵素であり、特に脳内に分布し、アミロイドA4前駆体タンパク代謝に関与しアルツハイマー病の原因究明の点からも注目されている。そこで基質認識機構の解明を目的としてX線解析に着手した。第一の目標は、高品位な結晶を作製し、高分解能に回折させる結晶を再現性良く得る。そこで、結晶の溶解度曲線(沈殿曲線)を作成し、結晶の核形成領域と準安定領域を実験的に決定した。PEPase結晶を1週間以内に再現性良く得ることが出来るようになった。結晶の空間群はP4_1に属し、格子定数はa=b=93.17Å,c=169.02Å、分解能は3.2Åであった。豚脳由来のPEPaseの構造を分子置換法で解き、精密化が進行中であるが、R=25.7%である。触媒ドメインと非触媒ドメインに大別され、前者は、α/βフォールドをとり、ジスルフィド結合により安定化されていた。活性部位は、触媒3残基(Ser536、Asp620、His655)を含み、2つのドメインの界面に位置していた。しかし、阻害剤-複合体分子も分解能が低く、高分解能の構造情報が得られない。そこで、機能解析と分子間相互作用の相関を計算し、薬剤の設計できるin silico実験系の構築を目指した。その試みとして、DyPを例に挙げる。(1)自動分注器の分注機械精度を活用し、沈殿曲線を作成し、結晶の核形成領域と準安定領域を実験的に決定し、新規の結晶を得た。"不完備要因実験"に基づき条件を検索し、応答曲面解析という多変量解析によって、条件を最適化し構造を決定した。(2)ネイティブ構造に、種々のアントラキノン基質を、ドッキング・シミュレーション計算し、基質-酵素相互作用を高精度に見積った。結合部位を予測し、基質や阻害剤の結合親和性を定量化し、それを利用して共結晶化した。解析して、基質の位置を確認した(投稿中)。(3)アミノ酸残基の側鎖のコンポメーション解析により、高磁場による構造の安定化によってリゾチーム結晶が良質化した。
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