ボツリヌス毒素複合体のサブユニット間相互作用およびX線結晶解析に関する研究

• 研究課題/領域番号: 15570103
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 構造生物化学
• 研究機関: 東京農業大学
• 研究代表者: 大山 徹 東京農業大学, 生物産業学部, 教授 (60318178)
• 研究分担者: 渡部 俊弘 東京農業大学, 生物産業学部, 教授 (80175695) ; 中川 智行 東京農業大学, 生物産業学部, 講師 (70318179)
• 研究期間 (年度): 2003 – 2004
• 研究課題ステータス: 完了 (2004年度)
• 配分額: 3,700千円 (直接経費: 3,700千円); 2004年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円); 2003年度: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
• キーワード: ボツリヌス毒素 / サブユニット構造 / X線結晶解析 / タンパク質複合体 / タンパク質間相互作用 / タンパク質問相互作用 / タンパク間相互作用

研究概要

ボツリヌス毒素は、1分子の神経毒素(約150kDa)に非毒非血球凝集素成分(NTNHA)と3種の血球凝集素成分(HA)の合計5種のタンパク質が非共有結合的に会合し、650kDaの巨大な分子量を有するサブユニット構造の複合体(TC)として培養液中に産生される。
本研究において、P型菌4947株(D-4947)を用い、複合体における個々のサブユニットタンパクの構成比を初めて明らかにした。すなわち、D-4947は、毒素複合体種(650kDaL-TC、610kDa TCおよび540kDa TC)を大量に産生する。いずれも同じSDS-PAGEパターンを示すが.複合体におけるHA-33/17の分子数が異なっていた。HA-33/17分子の各TC種への滴定実験によち、完全型のD型ボツリヌス650kDa L-TCは、神経毒素およびNTNHAが各1分子、HA-70が2分子、HA-33およびHA-17が各4分子からなるヘテロ12量体サブユニット構造であると結論した。これにより、ボツリヌス毒素複合体のX線結晶解析による高次構造解析のための情報を得た。また、D-4947毒素複合体種のうち、610kDa TCおよび546kDa TCは、温度などの保存条件により影響を受け、その構成成分の組換えが起こることを見出した。グリセロールなどの添加により抑制することが出来、安定な毒素複合体を実験に供することが可能となった。一方、従来法では困難であったD-4947ボツリヌス毒素複合体から神経毒素と無毒成分の大量分離・精製法を新たに確立した。さらにCおよびD型の4株から得られた毒素複合体(M-TCおよびL-TC)の純度を動的光散乱測定により検定し、各々の結晶化を130通り実験条件により試みたが、解析に供する大きな結晶は得られていない。

研究成果

• [雑誌論文] Structure and function of the Clostridium botulinum serotypes C and D toxin complex (2005)
  • 著者名/発表者名: Watanabe, T.
  • 雑誌名: Research Signpost ページ: 17-33
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Characterization of the interaction between subunits of the botulinum toxin complex produced by serotype D through tryptic susceptibility of the isolated components and complex forms. (2005)
  • 著者名/発表者名: Suzuki T, Watanabe T, Mutoh S, Hasegawa K, Kouguchi H, Fujinaga F, Oguma K, Ohyama, T.
  • 雑誌名: Microbiology -UK 151
• [雑誌論文] Characterization of toxin complex produced by a uniqe strain of Clostridium botulinum serotype D4947 (2004)
  • 著者名/発表者名: Hasegawa, K.
  • 雑誌名: The Protein Journal 23 ページ: 371-378
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] The receptor and transporter for internalization of Clostridium botulinum type C progenitor toxin into HT-29 cells (2004)
  • 著者名/発表者名: Nishikawa, A.
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 25 ページ: 327-333
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Molecular characterization of binding subcomponents of Clostridium botulinum type C progenitor toxin for intestinal epithelial cells and erythrocytes (2004)
  • 著者名/発表者名: Fujinaga, Y.
  • 雑誌名: Microbiology 150 ページ: 1529-1538
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Molecular characterization of binding subcomponents of Clostridium botulinum type C progenitor toxin for intestinal cells and erythrocytes (2004)
  • 著者名/発表者名: Fujinaga, Y., Inoue, K., Watarai, S., Sakaguchi, Y., Arimitsu, H., Lee, J.C., Jin, Y., Matsumura, T., Kabumoto, Y., Watanabe, T., Ohyama, T., Nishikawa, A., Oguma, K.
  • 雑誌名: Microbiology Vol.150 ページ: 1529-1538
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] The receptor and transporter for internalization of Clostridium botulinum type C progenitor toxin into HT-29 cells (2004)
  • 著者名/発表者名: Nishikawa, A., Uotsu, N., Arimitsu, H., Lee, J.C., Miura, Y., Fujinaga, Y., Nakada, H., Watanabe, T., Ohyama, T., Sakano, Y., Oguma, K.
  • 雑誌名: Biochem.Biophys.Res.Commun. Vol.319 ページ: 327-333
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Characterization of Toxin Complex Produced by a Unique Strain of Clostridium botulinum type D 4947 (2004)
  • 著者名/発表者名: Hasegawa, K., Watanabe, T., Sato, H., Sagane, Y., Mutoh, S., Suzuki, T., Yamano, Y., Kouguchi, H., Takeshi, K., Kamaguchi, A., Fujinaga, Y., Oguma, K., Ohyama, T.
  • 雑誌名: Protein J. Vol.23 ページ: 371-378
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Characterization of Toxin Complex Produced by a Unique Strain of Clostridium botulinum type D 4947. (2004)
  • 著者名/発表者名: Hasegawa K, Watanabe T, Sato H, Sagane Y, Mutoh S, Suzuki T, Yamano Y, Kouguchi H, Takeshi K, Kamaguchi A, Fujinaga Y, Oguma K, Ohyama T.
  • 雑誌名: Protein J. 23 ページ: 371-378
• [雑誌論文] Molecular characterization of GroES and Gro EL Homologues from Clostridium botulinum (2003)
  • 著者名/発表者名: Sagane, S.
  • 雑誌名: Journal of Protein Chemistry 22 ページ: 99-108
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Complete subunit structure of the Clostridium botulinum type D toxin complex via intermediate assembly with nontoxic components (2003)
  • 著者名/発表者名: Mutoh, S.
  • 雑誌名: Biochemistry 42 ページ: 10991-10997
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Purification of fully activated Clostridium botulinum serotype B toxin for treatment of patients with dystonia (2003)
  • 著者名/発表者名: Arimitsu, H.
  • 雑誌名: Infection and Immunity 71 ページ: 1599-1603
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Molecular Characterization of GroES and GroEL Homologues from Clostridium botulinum (2003)
  • 著者名/発表者名: Sagane, Y., Hasegawa, K., Mutoh, S., Kouguchi, K., Suzuki, T., Sunagawa, H., Nakagawa, T., Kamaguchi, A., Okasaki, S., Nakayama, K., Watanabe, T., Oguma K., Ohyama, T.
  • 雑誌名: J.Protein Chem. Vol.22 ページ: 99-108
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Purification of Fully Activated Clostridium botulinum Serotype B Toxin for Treatment of Patients with Dystonia (2003)
  • 著者名/発表者名: Arimitsu, H., Inoue, K., Sakaguchi, Y., Lee, J.C., Fujinaga, Y., Watanabe, T., Ohyama, T., Hirst, R., Oguma, K.
  • 雑誌名: Infect.Immun. Vol.71 ページ: 1599-1603
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Complete Subunit Structure of Clostridium botulinum Type D Toxin Complex via Intermediate Assembly with Nontoxic Components (2003)
  • 著者名/発表者名: Mutoh, S., Kouguchi, H., Sagane, Y., Suzuki, T., Hasegawa, K., Watanabe, T., Ohyama, T.
  • 雑誌名: Biochemistry Vol.37 ページ: 10991-10997
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Complete Subunit Structure of Clostridium botulinum Type D Toxin Complex via Intermediate Assembly with Nontoxic Components. (2003)
  • 著者名/発表者名: Mutoh S, Kouguchi H, Sagane Y, Suzuki T, Hasegawa K, Watanabe T, Ohyama T.
  • 雑誌名: Biochemistry 37 ページ: 10991-10997
• [図書] Structure and function of the Clostridium botulinum serotypes C and D toxin complex (2005)
  • 著者名/発表者名: Watanabe T., Sagane, Y., Mutoh, S., Suzuki, T., Hasegawa, K., Kouguchi, H., Ohyama, T.
  • 出版者: Research Signpost
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [図書] Structure and Function of the Clostridium botulinum Serotypes C and D Toxin Complex. (2005)
  • 著者名/発表者名: Watanabe T, Sagane Y, Mutoh S, Suzuki T, Hasegawa K, Kouguchi H, Ohyama T.
  • 総ページ数: 17
  • 出版者: Research Signpost
• [文献書誌] Mutoh, S., Kouguchi, H., Sagane, Y., Suzuki, T., Hasegawa, K., Watanabe, T., Ohyama, T.: "Complete Subunit Structure of the Clostridium botulinum Type D Toxin Complex via Intermediate Assembly with Nontoxic Components"Biochemistry. 42. 10991-10997 (2003)