| 研究課題/領域番号 |
15570115
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
機能生物化学
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
白井 康仁 神戸大学, バイオシグナル研究センター, 助教授 (60263399)
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| 研究分担者 |
齋藤 尚亮 神戸大学, バイオシグナル研究センター, 教授 (60178499)
谷口 泰造 神戸大学, バイオシグナル研究センター, 講師 (70346253)
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| 研究期間 (年度) |
2003 – 2004
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| 研究課題ステータス |
完了 (2004年度)
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| 配分額 *注記 |
3,700千円 (直接経費: 3,700千円)
2004年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円)
2003年度: 2,400千円 (直接経費: 2,400千円)
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| キーワード | プロテインキナーゼC / ジアシルグリセロールキナーゼ / C1ドメイン / NMR / 脂肪酸 / 脂質シグナル / セラミド / PKC / DGK |
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| 研究概要 |
PKC及びDGKに存在する脂肪酸応答ドメインの高次構造を明らかにする研究の一環として、以下の研究を行った。
まず、PKC及びDGKの脂肪酸応答ドメインの同定を行ったところ、εPKCとDGKγにおいてはC1AではなくC1Bドメインが脂肪酸と相互作用すると予想された。一方、γPKCはC1AとC1Bのどちらかがあれば充分であった。ついで、NMR解析に供するため、DGKγC1A及びC1BドメインとGSTまたはMBPとの融合蛋白質を作製を試みた。最終的に、500mlの大腸菌培養液から約0.5mgのMBP-DGKγC1A及びMBP-DGKγC1Bを得た。一方、GST融合蛋白質の収量は非常に少なかった。そこで、MBP-DGKγC1A及びMBP-DGKγC1Bをプロテアーゼ処置によりタグを切断した後、Superose 6HRを用いたゲルろ過に供した。しかし、目的のペプチドが得られなかった。そこで、より微量なペプチドを検出するために、C末端にもFLAGタグを融合したMBP-DGKγC1A-FLAG及びMBP-DGKγC1B-FLAGを作製し、同様の実験を行った。その結果、DGKγC1A-FLAGとDGKγC1B-FLAGは、ともにボイドボリュームに溶出され、aggregationを起こしている可能性が強く示唆された。この傾向は、同様に作製したMBP-DGKγC1-FLAG, MBP-εPKCC1-FLAG及びMBP-εPKCC1A-FLAGでも認められた。また、作製した各融合蛋白質を再フォールディング後、PDBu結合能を測定したが、有意な結合は認められなかった。以上のことから、MBP融合PKC及びDGKのC1ドメインを大腸菌を用いて発現させた場合には、正常な高次構造を保持していない可能性が示唆された。今後、HAタグや、バキュロウイルス発現系など対応策を講じていく必要があると思われる。
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