| 研究課題/領域番号 |
15580066
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用微生物学
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| 研究機関 | 富山県立大学 |
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研究代表者 |
加藤 康夫 富山県立大学, 工学部, 助教授 (20254237)
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| 研究分担者 |
浅野 泰久 富山県立大学, 工学部, 教授 (00222589)
米田 英伸 富山県立大学, 工学部, 助手 (50285160)
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| 研究期間 (年度) |
2003 – 2004
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| 研究課題ステータス |
完了 (2004年度)
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| 配分額 *注記 |
3,800千円 (直接経費: 3,800千円)
2004年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
2003年度: 2,900千円 (直接経費: 2,900千円)
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| キーワード | aldoxime dehydratase / nitrile hydratase / nitrilase / Rhodococcus / Bacillus / dehydration / enzyme / screening |
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| 研究概要 |
有機化学、酵素化学工学、微生物学等のさまざまな分野の知識・手法を総合的に駆使することで、1)アルドキシム・デヒドラターゼ(Oxd)のメカニズム解明、2)アルドキシム-ニトリル経路の生理学的意義の解明、に関する基礎的知見を得ることを目的とし、以下の研究を行った。
(1)Bacillus由来のニトリラーゼ(Nit)リンク型oxd遺伝子の、遺伝子組み換え大腸菌による大量発現系を構築し、最適培養条件を見いだすことで活性型Oxdを大量にかつ安定に生産することができた。
(2)本酵素の酵素学的諸性質を詳細に検討するとともに、分子分光学的手法等を用いた解析により、酵素反応メカニズムを推定した。
(3)(1)で得られた最適培養条件下にて培養した、遺伝子組み換え大腸菌よりOxd純品を数百ミリグラム調整し、このサンプルを用いて本酵素の結晶化条件探索を開始した。
(4)保存菌、土壌分離菌より広く検索することで、ニトリル・ヒドラターゼ(NHase)とリンクしてOxd活性を有する微生物株を選出した。
(5)(4)で活性株として見いだされたRhodococcus globerulus A-4株中より、Oxd(NHaseリンク型)を高度に精製し、以前精製したNitリンク型のOxdと酵素学的諸性質の比較検討を行った。
(6)(5)で精製された本脱水酵素のN-末端アミノ酸配列の情報を元に、同菌のゲノムライブラリー中より、oxd遺伝子をクローニングした。本遺伝子近傍塩基配列を解析し、oxd遺伝子とNHase等のニトリル分解酵素およびその調節・修飾蛋白遺伝子がクラスターを形成して存在していることを見いだした。
(7)NHase生産菌として以前単離されたR.erythropolis N-771株のアミダーゼ遺伝子上流に見いだされたOxdホモログ遺伝子の全長をクローニングし、大腸菌による各種発現系を構築した。最適培養条件下で培養した組み換え菌体より、単段階で本酵素を精製し、その詳細な諸性質について検討を行い、既知のOxd類と比較検討を行った。
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