| 研究課題/領域番号 |
15580069
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用微生物学
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| 研究機関 | 大阪薬科大学 |
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研究代表者 |
宮本 勝城 大阪薬科大学, 薬学部, 講師 (40231625)
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| 研究期間 (年度) |
2003 – 2004
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| 研究課題ステータス |
完了 (2004年度)
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| 配分額 *注記 |
3,600千円 (直接経費: 3,600千円)
2004年度: 700千円 (直接経費: 700千円)
2003年度: 2,900千円 (直接経費: 2,900千円)
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| キーワード | 海洋細菌 / レスポンスレギュレーター / ヒスチジンキナーゼ / キチン / プロテアーゼ / ArcA / ArcB |
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| 研究概要 |
キチン分解系に関与する遺伝子の発現調節タンパク質のN末端アミノ酸配列を決定した結果、本タンパク質は細菌の2成分制御系のレスポンスレギュレーターArcAに相同性を有するタンパク質である可能性が示唆された。そこで、ArcAおよび本タンパク質をリン酸化するArcB遺伝子のクローニングを行い、高発現系を構築した。本科学研究経費補助金により導入したAKTAprimeを用いてグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(Gst)との融合タンパク質(GstArcAおよびGstArcBΔN)を精製した。GstArcAおよびArcAを用いてゲルシフトアッセイを行ったところ、両タンパク質はaprIV遺伝子上流域に結合することが明らかとなった。次に、リン酸化ArcA(ArcA-P)が共通配列を認識するかどうかについて検討する目的で、[γ-^<32>P]ATPを用いてGstArcBΔNのArcAリン酸化能について検討した。その結果、GstArcBΔNはArcAをリン酸化することが明らかとなった。さらに、ArcAおよびArcA-Pを用いてゲルシフトアッセイを行った結果、ArcA-PはArcAと比較して約2倍の結合能を有していた。次に、本菌株のキチン分解機構に関与するタンパク質であるchiA、chiB、chiC、chiD、obp1およびaprIV遺伝子上流域に対するArcA-Pの結合能について比較した。その結果、ArcA-PはすべてのDNA断片に結合能を有するが、特にchiDおよびaprIV遺伝子上流域との結合において、他のDNA断片と比較してその移動度に顕著な差があることを認めた。そこで、ArcA-PのそれらDNA断片に対する結合能を詳細に解析する目的で、BIACOREを用いて検討した。その結果、chiDおよびaprIV遺伝子上流域との結合において、他のDNA断片と比較して結合能に顕著な差があることを認めた。次に、ArcA-PのchiDおよびaprIV遺伝子上流域における結合領域を明らかにする目的で、フットプリンティングを行った。その結果、ArcA-Pは両遺伝子の転写開始点直前および直後の複数個所を認識して結合することが明らかとなった。
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