| 研究課題/領域番号 |
15580070
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用微生物学
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| 研究機関 | 崇城大学 |
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研究代表者 |
田口 久貴 崇城大学(旧熊本工業大学), 生物生命学部, 助教授 (90212018)
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| 研究分担者 |
赤松 隆 崇城大学(旧熊本工業大学), 生物生命学部, 教授 (50133567)
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| 研究期間 (年度) |
2003 – 2005
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| 研究課題ステータス |
完了 (2005年度)
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| 配分額 *注記 |
3,700千円 (直接経費: 3,700千円)
2005年度: 700千円 (直接経費: 700千円)
2004年度: 700千円 (直接経費: 700千円)
2003年度: 2,300千円 (直接経費: 2,300千円)
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| キーワード | 高頻度形質転換 / 枯草菌 / プロトプラスト / コンビテント細胞 / pBluescript II / pC194 / DNA結合タンパク質 / インバーティッドリピート / コンピテント細胞 / DNA結合たんぱく質 / 2本鎖DNA / pBluescriptII / pBluescriput II |
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| 研究概要 |
pC194に大腸菌ベクターpBluescriputIIを連結したpCB1(精製DNA:7×10^4、無精製DNA:4×10^8)では、pC194(精製DNA:2×10^3、無精製DNA:2×10^2)より高頻度に形質転換体が得られる。この高頻度形質転換の機構解明を本研究の目的とする。
(1)高頻度をもたらすpBluescriputII上の配列の特定
pBluescriputIIのf1から1ac'遺伝子にまたがる約270bの領域を持つクローンで、pCB1の約20%の形質転換率を得た。この値は、pC194による形質転換率の約3万倍に当たる。この領域はGC含量が高く(61%)、2個のインバーティッドリピートが存在することが分かった。これらリピートとDNA結合タンパク質との相互作用の可能性が考えられた。
(2)DNA結合タンパク質の分離精製技術の開発
pUB110を有する枯草菌のプロトプラストを調製後、セファクリルS500HRカラム(1.5×17cm)上で溶菌してゲル濾過によるpUB110の分離を行った(1.5ml分画)。ボイド体積付近に、形質転能を有するpUB110が溶出した。大部分の細胞内タンパク質画分はpUB110画分の直後から溶出し、染色体DNAの画分はタンパク質画分の後半に溶出した。分離したpUB110画分をアガロース電気泳動して、精製pUB110のバンドと比較した。その結果、分離pUB110バンドの移動度に、精製pUB110のものより明らかに遅延が認められた。この遅延はDNA結合タンパク質によるものと考えられた。pUB110の結合タンパク質のSDS-PAGEによる解析を行った。pUB110無保有株より同様の分離を行い、保有菌株とのタンパク質バンドの比較を行った。その結果、分子量143、109、78、58、54、50、48、42、38kdのバンドで顕著な差が認められた。
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