| 研究課題/領域番号 |
15580072
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用生物化学
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| 研究機関 | 弘前大学 |
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研究代表者 |
宮入 一夫 弘前大学, 農学生命科学部, 教授 (10003526)
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| 研究分担者 |
加藤 博章 京都大学, 薬学研究科, 教授 (90204487)
吉田 孝 弘前大学, 農学生命科学部, 助教授 (80200997)
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| 研究期間 (年度) |
2003 – 2004
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| 研究課題ステータス |
完了 (2004年度)
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| 配分額 *注記 |
2,800千円 (直接経費: 2,800千円)
2004年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
2003年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
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| キーワード | エンドポリガラクツロナーゼ / Stereum purpureum / 一般酸塩基触媒 / X線結晶構造解析 / 原子分解能 / ペクチナーゼ / 一般酸・塩基触媒 / 原子分解能X線結晶構造解析 |
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| 研究概要 |
○pH2.5でのX線結晶構造解析による一般塩基触媒の決定
生成物との複合体結晶解析から当初Asp174とAsp153が一般塩基触媒候補と考えられていた。そこでpKa1の4.35よりはるかに低いpH2.5では、一般塩基触媒はプロトン化しているはずである。pH2.5でのX線結晶構造解析の結果、Asp153のみがプロトン化しているのが観察された。この結果からAsp153が一般塩基触媒である可能性が極めて高いことがわかった。
○変異体酵素の作成とその解析
エンドポリガラクツロナーゼに保存されていると考えられるAsp153,156,173,174の変異体酵素をQuikChangeIIシステムを用いた部位特異的変異導入法により作成した。用いたベクターはpET11b、宿主大腸菌はOrigamiによった。作成された4種類の変異体酵素には全くPG活性はみとめられなかった。したがって、一般酸触媒のAsp173、一般塩基触媒のAsp153は当然であるが、Asp156はAsp153とLow-Barrier-Hydrogen-Bondを形成しており、Asp153と密接な関係があるものとおもわれる。また、基質認識にはサブサイト+1のカルボキシル基の認識に3つの塩基性アミノ酸が重要であり、これらの静電作用が+1の親和力の強さを反映していると考えられる。
○変異体酵素(D173N)の複合体結晶のX線結晶構造解析
一般酸触媒のAsp173については変異体酵素(D173N)と6GalAの共結晶により複合体を作成し、X線結晶構造解析を行った。その結果サブサイトは+1から-4まで5つあることが明らかにされた。また、サブサイト-1のGalAの歪みが予想より小さかったが、これはD173Nの影響と考えられる。
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