| 研究課題/領域番号 |
15580119
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
林学・森林工学
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| 研究機関 | 宇都宮大学 |
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研究代表者 |
横田 信三 宇都宮大学, 農学部, 助教授 (60210613)
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| 研究期間 (年度) |
2003 – 2005
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| 研究課題ステータス |
完了 (2005年度)
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| 配分額 *注記 |
2,800千円 (直接経費: 2,800千円)
2005年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
2004年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
2003年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
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| キーワード | カバノアナタケ / シラカンバ / 菌感染特異的タンパク質 / プロテオーム / 樹菌 / 二次元電気泳動 / オキシダティブバースト / シャペロニン / 樹病 / 宿主特異的抵抗性 |
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| 研究概要 |
本研究では、カンパ類の癌腫病菌であるカバノアナタケの異なる2菌株、IO-U1株又はIO-B2株の感染によって、シラカンバ幼植物体No.8内に生成する感染特異的タンパク質を検出し、データベースを基に検出されたタンパク質の推定及び同定を行った。カバノアナタケIO-U1株又はIO-B2株を接種したシラカンバ幼植物体(処理区)、対照区1(無菌・無傷)及び対照区2(傷害)の各植物体を、菌接種後0〜7日間毎日採取した。これらを液体窒素で急速凍結後、粉砕し、タンパク質抽出緩衝液を用いて粗タンパク質溶液を調製した。得られた粗タンパク質溶液を濃縮、脱塩し、色素結合法によってタンパク質含量を測定した後、二次元電気泳動に供した。泳動後、ゲルを銀染色し、乾燥後スキャナーでコンピューターにその画像を取り込み、画像解析を行った。画像解析によって検出された感染特異的タンパク質の等電点と分子量を基に、データベースで相当するタンパク質を検索した。その結果、オキシダティブバーストに関与するタンパク質として炭酸脱水酵素、NADH酸化還元酵素、シトクロムCオキシダーゼ、グルタチオン S-トランスフェラーゼ(GST)、L-アスコルビン酸ペルオキシダーゼ及びグルタチオンペルオキシダーゼが相当するものとして見出された。また、それ以外のタンパク質としてPR10-1、カフェオイル-CoA O-メチルトランスフェラーゼ、ガルコン・フラボノンイソメラーゼ、熱ショック70kDaタンパク質、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ、20Sプロテアソーム及びカルレティキュリンの生成が推定された。IO-U1株の場合、オキシダティブバーストに関与するタンパク質が多くの日数で認められた。また、IO-B2株の場合にも、オキシダティブバーストに関与するタンパク質が見出された。従って、カバノアナタケIO-U1株及びIO-B2株感染のどちらの場合においても、菌感染一週間以内では、シラカンバ幼植物体内の主な防御反応として、オキシダティブバーストが生じていることが推察される。一方、IO-U1株感染の場合、感染後2日目に多くの感染特異的タンパク質が検出されたため、この幼植物体から同様にしてタンパク質サンプルを調製した。これを二次元電気泳動に供し、ゲルを改変銀染色した。12個の感染特異的タンパク質スポットをゲルから切り取り、ゲル内消化後、マトリックス支援レーザー脱離イオン化・飛行時間型質量分析計を用いて分析した。得られたマススペクトルのペプチドマップを用いて、Mascotによりデータベース検索した。その結果、GST及び60kDaシャペロニンが、菌感染特異的タンパク質として同定された。このことから、IO-U1株に感染したシラカンバ幼植物体No.8において、防御機構としてオキシダティブバーストが生じ、防御遺伝子の発現が活性化していることが判明した。
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