| 研究課題/領域番号 |
15580146
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
林産科学・木質工学
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
島田 幹夫 京都大学, 生存圏研究所, 教授 (50027166)
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| 研究分担者 |
服部 武文 京都大学, 生存圏研究所, 助手 (60212148)
馬場 啓一 京都大学, 生存圏研究所, 助手 (20238223)
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| 研究期間 (年度) |
2003 – 2004
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| 研究課題ステータス |
完了 (2004年度)
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| 配分額 *注記 |
3,200千円 (直接経費: 3,200千円)
2004年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
2003年度: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
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| キーワード | オオウズラタケ / 銅耐性菌 / イソクエン酸リアーゼ / シュウ酸 / 木材腐朽菌 / cDNAクローニング / 細胞内局在 / グリオキシル酸回路 / 褐色腐朽菌 / CDNAクローニング / グリオキシル酸 |
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| 研究概要 |
森林微生物キノコの担子菌類(木材腐朽菌と外生菌根菌類)には、生理学的にシュウ酸を分泌するものが多い。木材腐朽菌、特に褐色腐朽菌にあってはその高いシュウ酸分泌・集積性のため銅薬剤の不活性化を招致しているが、逆に樹木と共生する菌根菌類はシュウ酸などのジカルボン酸を土壌中に分泌することにより、不可給態リンを可給態」リン酸として遊離させる働きがあり、樹木の成長を助ける菌類として重要視されている。そこで、細胞内でのシュウ酸生合成サイトの局在性を解明し腐朽菌のシュウ酸生合成を抑制あるいは共生菌ではその生合成を促進させたりすることにより、森林資源の木材の保護と育成に応用する研究開発が重要となる。現在、銅耐性褐色腐朽菌オオウズラタケのシュウ酸合成の鍵酵素であるイソクエン酸リアーゼ(ICL)を単離、精製することに成功しているので、その全長をコードするcDNAを決定することに成功した。このcDNA断片を鋳型として、3つのDNA断片(塩基対の長さが異なるDNA断片:ICLa,ICLb,ICLc)をPCR法によって調製した。そこで、これらのDNA断片pET32Ek/LICベクターシステム(Novagen)用いて、N末端領域のアミノ酸が決失したポリペプチドを大腸菌(E.coli)BL21(DE3)で大量発現させた。これら3つのポリペプチドの中でICLbだけが抗体調製に利用できることがわかった。白ウサギ(2.5Kg)に週間毎に約1〜2mgの組み換えタンパク質を3回注射し、抗体を調製した。この抗体の金粒子標識のウサギ抗体を用いて電子顕微鏡解析票品を調製した。これとは別に細胞内オルガネラであるミトコンドリアとペルオキシゾームを蔗糖密度勾配遠心分離方によって分画しペルオキシゾームのマーカーであるカタラーゼ反応を利用しペルオキシゾームを確認し、ICL酵素活性はミトコンドリアではなくペルオキシゾーム画分に分布することがわかった。また。免疫電子顕微鏡観察によって標識金粒子はミトコンドリアではなくペルオキシゾームに局在することを確認した。
以上の結果から、木材腐朽担子菌から初めてグリオキシル酸回路酵素はペルオキシゾームに局在することを明らかにした。
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