| 研究概要 |
機能遺伝子を用いた硫酸還元細菌(SRB)の検出と活性評価法の開発のため,異化的硫酸還元過程の最終段階で働く亜硫酸還元酵素をコードしている遺伝子(dsr)の解析を行った。データベースに登録されている塩基配列をもとにPCRプライマーを作成した。SRBの19種27株からDNAを抽出し,作成したプライマーを用いてPCRを行ったところ,全ての株で予想された長さのPCR産物が得られた。数種の非SRBからはPCR産物の増幅は認められなかった。さらに,河口堆積物および密度成層湖水から抽出したDNAを鋳型にPCRを行い,PCR産物のクローンの塩基配列を決定したところ,全てのクローがdsrであった。これらの結果から,作成したプライマーはSRBのdsrに特異的であることが確認できた。次に,このプライマーを用いた定量的PCR法によるSRBの計数方法の検討を行った。段階希釈した既知量の競合DNAをPCR反応液に加えて行う競合PCRによってSRB数を推定する方法の開発に成功した。堆積物あるいはフィルターで捕集した細菌細胞に既知量のSRB細胞を添加してDNAを抽出し,競合PCRでSRB細菌数を計数したところ,添加したSRB細胞数と競合PCRで検出される細胞数には比例関係が認められた。有機物汚濁の進行した湖沼,河口域の堆積物中あるいは水中のSRBを計数したところ,従来の培養計数法で計数されるSRB数よりも数桁高い計数値が得られた。以上の結果から,今回開発した競合PCR法は環境中のSRBを計数する方法として非常に優れていると考えられる。
また,競合鋳型RNAを作成し,競合RT-PCRによるdsrの転写量を定量する方法を開発した。一細胞あたりの硫酸還元活性が異なる硫酸還元細菌細胞を調整し,全RNAを抽出して,競合RT-PCRでdsrの転写量を定量したところ,硫酸還元活性が異なればdsrの転写量が異なることが示された。
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