| 研究課題/領域番号 |
15590108
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
創薬化学
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| 研究機関 | 独立行政法人産業技術総合研究所 |
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研究代表者 |
西川 諭 独立行政法人産業技術総合研究所, 年齢軸生命工学研究センター, 副研究センター長 (60357704)
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| 研究期間 (年度) |
2003 – 2004
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| 研究課題ステータス |
完了 (2004年度)
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| 配分額 *注記 |
3,100千円 (直接経費: 3,100千円)
2004年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
2003年度: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
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| キーワード | RNAアプタマー / C型肝炎ウイルス / NS3プロテアーゼ / NS3ヘリカーゼ / IRES / FRET / リボザイム / アプタマー |
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| 研究概要 |
1)アプタマーのインビボ活性評価系の開発。
抗NS3プロテアーゼアプタマーの細胞内での阻害効果を定量的、かつ鋭敏に測定できる系として、Green Fluorescent Protein(GFP)を利用したFRET測定法を開発した。
2)HDVリボザイムを利用した抗HCVプロテアーゼアプタマーのタンデムリピート発現プラスミドの構築。
HDVリボザイムを利用し抗HCVNS3プロテアーゼG9アプタマーを連結したHDV-G9アプタマーを作成した。これによりRNAアプタマーの形がコンパクトとなり、細胞内での安定化を図れた。さらにそのユニットをくり返した発現ベクターを作成し、一度の導入で大量発現を行った。アプタマー遺伝子を4回繰り返すことにより、阻害効果を60%まで上昇できることを見出した。
3)抗NS3プロテアーゼアプタマーならびに抗NS3ヘリカーゼアプタマーコンジュゲート発現ユニットの構築ならびに評価。
HCVのNS3ヘリカーゼドメインに対するRNAアプタマーを創出した。次に、プロテアーゼに対するアプタマーと接続することで、異なった酵素機能を持つタンパク質を相加的に阻害する多機能な新機能性核酸(Bifunctional aptamer)を種々デザインした。この多機能型アプタマーはNS3蛋白質に対して、プロテアーゼ/ヘリカーゼの異なる2箇所ならびに2段階で作用でき、また蛋白質分子を複数個捕捉でき、単独より効果が高いことを明らかにできた。
4)HCV IRESに特異的な新規アプタマーの創出
HCV IRESは亜種ウイルス間で保存性が高く、また特有の二次構造を持つ。この領域に対してどのようなRNAアプタマーが得られるかを検証するため、インビトロ法により抗IRESアプタマーを創出した。得られたRNAアプタマーはループ・ループ間のKissing interactionにより結合していることを明らかにした。特にドメインIIIdに特異的に結合し、翻訳を阻害する分子が得られ、ドメインIIIdの機能的重要性を明らかにするとともに、HCV抑制のための標的探索に優れた方法であることを明らかにした。
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