| 研究課題/領域番号 |
15590293
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
人類遺伝学
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| 研究機関 | 琉球大学 |
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研究代表者 |
要 匡 琉球大学, 医学部, 助教授 (40264288)
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| 研究分担者 |
成富 研二 (成冨 研二) 琉球大学, 医学部, 教授 (20101446)
柳 久美子 琉球大学, 医学部, 助手 (90294701)
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| 研究期間 (年度) |
2003 – 2004
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| 研究課題ステータス |
完了 (2004年度)
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| 配分額 *注記 |
2,400千円 (直接経費: 2,400千円)
2004年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
2003年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
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| キーワード | ヒト人工染色体 / BAC / X染色体 / 部位特異的組換え / 遺伝子治療 / DT40 / 相同組換え |
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| 研究概要 |
<ミニ染色体改変システムの構築,検証と応用>
1)BAC(細菌人工染色体)導入システムの構築と検証
テロメア断片化ベクターにより作製された約2.7MbのヒトX染色体由来ミニ染色体に、さらに改変を加え、反応方向特異性をもつ部位特異的組換え系(Cre/変異loxP)を用いたBAC導入システムを構築した。導入用BACには、作製済みベクターを用いた(Kaname and Huxley, BioTechniques 31:273(2001))。ヒトHPRT遺伝子を含む改変BAC(HPRTBAC66D2)をミニ染色体へ導入した場合の挿入効率は約75%であった。他のBAC(ヒトFactor IX遺伝子を含むF9BAC66D2)においても、効率は同程度(約80%)であった。一方、ネオマイシン耐性遺伝子発現ユニットのみをもつプラスミド(4.5kb)の挿入効率は、100%と非常に高率であった。ヒトHPRT遺伝子を挿入したミニ染色体は、これを保持しているニワトリpre-B細胞株(DT40)において、遺伝子発現が認められた。よって、このシステムは、遺伝子全体をミニ染色体に挿入するシステムとして、有効であることが示された。(投稿中)
2)染色体ベクターとしての応用
改変(挿入)を行ったミニ染色体の、宿主細胞であるDT40から他の細胞への移入を行った。
ヒトHPRT遺伝子をもつミニ染色体を微小核融合法により、線維肉腫細胞亜株(HT1080,HPRT(-))へ移入した。G418耐性を指標にクローン(HT1080,HPRT(-))を検討したところ、ミニ染色体は、細胞あたりのコピー数に変動が見られる(1〜8コピー)ものの、安定に存在していた。また、HPRT遺伝子発現も効率よく認められた。よって、このミニ染色体は、遺伝子導入のための染色体ベクターとして有効であると考えられた。
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