黄色ブドウ球菌2成分溶血毒素の形成するヘテロヘプタマー膜孔超分子の構造解析

• 研究課題/領域番号: 15590380
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 細菌学(含真菌学)
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 冨田 敏夫 東北大学, 大学院・農学研究科, 助教授 (00126129)
• 研究分担者: 神尾 好是 東北大学, 大学院・農学研究科, 教授 (00109175)
• 研究期間 (年度): 2003 – 2004
• 研究課題ステータス: 完了 (2004年度)
• 配分額: 3,700千円 (直接経費: 3,700千円); 2004年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円); 2003年度: 2,500千円 (直接経費: 2,500千円)
• キーワード: 黄色ブドウ球菌 / γヘモリジン / 2成分性溶血毒素 / 膜孔 / 分子構築 / 立体構造 / 電子顕微鏡 / 分子配列 / 二成分性溶血毒素

研究概要

黄色ブドウ球菌γヘモリジンはHlg1(34kDa)とHlg2(32kDa)から成る二成分性溶血毒素である。我々は、γヘモリジンの二成分がヒト赤血球膜上で外径9nm、内径3nmのリング状複合体を形成し、この複合体が実効内径2nmの膜孔として作動して溶血を起こすことを示した。さらに、電子顕微鏡および化学的架橋剤を使用した研究により、膜孔複合体はヘプタマーであり、二成分はモル比3:4または4:3で交互に配列していると推定した。本研究では、(1)nanogoldでラベルしたグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)を融合したGST融合Hlg1(またはGST融合Hlg2)とwild typeのHlg2(またはwild typeのHlg1)から膜孔複合体を形成させ、電子顕微鏡を使用して膜孔複合体中のナノゴールドを観察することで毒素2成分の分子配列の可視化、(2)電子顕微鏡による立体構造の解析を試みた。(1)GST1分子当たり1個のナノゴールドを結合した融合毒素を作製するために、GSTに含まれる4個のシステインの内(138番目のシステインを除く残り)3個をアラニンに置換した組換え体GSTを作製した。現在、ナノゴールドによってラベルした融合毒素と未結合のナノゴールドを分離する方法について検討中である。また、(2)本毒素複合体は2成分を3:4または4:3で含むために、X線結晶回折による3次元構造の解明は困難であると予測されるために、ヒト赤血球膜から単離した膜孔複合体をネガテイブ染色して透過型電子顕微鏡によって立体構造の解析をおこなった。その結果、膜孔複合体は直径約3nmの細長いモノマー分子が平行に並び、高さ約10nm、横幅約9nmの構造であることが明らかになった。様々な角度から撮影した像から、γヘモリジンの膜孔複合体は、黄色ブドウ球菌の1成分溶血毒素αヘモリジンの立体構造に類似したマッシュルーム状の形態を有することが示された。

研究成果

• [雑誌論文] Pleurotolysin, a novel sphingomyelin-specific two-component cytolysin from the edible mushroom Pleurotus ostreatus, assembled into a transmembrane pore complex. (2004)
  • 著者名/発表者名: Tomita, T., Noguchi, K., Mimuro, H., Ukaji, F., Ito, K., Sugawara-Tomita, N., Hashimoto, Y.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 279 ページ: 26975-26982
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Protein sequence analysis, cloning an expression of flammutoxin a pore-forming cytolysin from Flammulina velutipes : Maturation of dimeric precursor to monomeric (2004)
  • 著者名/発表者名: Tomita, T., Mizumachi, Y, Chong, K, Ogawa, Konishi, Sugawara Tomita, N., Dohmae, N, Hashimoto Y, Takio
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 279 ページ: 54161-54172
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Cloning expression, and pore-forming properties of mature and precursor forms of pleurotolysin, a sphingomyelin-specific two-component cytolysin from the edible (2004)
  • 著者名/発表者名: Sakurai, N., Kaneko, J., Kamio, Y., Tomita, T.
  • 雑誌名: Biochim.Biophys.Acta 1679 ページ: 65-73
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Effect of a pore-forming protein derived from Flammulina velutipes on the Caco-2 intestinal epithelial cell monolayer. (2004)
  • 著者名/発表者名: Narai, A., Watanabe, H., Iwanaga, T., Tomita, T., Shimizu, M.
  • 雑誌名: Biosci.Biotechnol.Biochem. 68 ページ: 2230-2238
  • NAID: 130000030909
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Pleurotolysin, a novel sphingomyelin-specific two-component cytolysin from the edible mushroom Pleurotus ostreatus, assembles into a transmembrane pore complex. (2004)
  • 著者名/発表者名: Tomita, T., Noguchi, K.Mimuro, H.Ukaji, F.Ito, K., Sugawara-Tomita, N., Hashimoto, Y.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 279 ページ: 26975-26982
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Protein sequence analysis, cloning and expression of flammutoxin, a pore-forming cytolysin from Flammulina velutipes : Maturation of dimeric precursor to monomeric active form by carboxyl-terminal truncation. (2004)
  • 著者名/発表者名: Tomita, T., Mizumachi, Y, Chong, K, Ogawa., Konishi, Sugawara Tomita, N., Dohmae, N, Hashimoto, Y., Takio, K.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 279 ページ: 54161-54172
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Cloning, expression, and pore-forming properties of mature and precursor forms of pleurotolysin, a sphingomyelin-specific two-component cytolysin from the edible mushroom Pleurotus ostreatus. (2004)
  • 著者名/発表者名: Sakurai, N., Kaneko, J., Kamio., Y., Tomita, T.
  • 雑誌名: Biochim.Biophys.Acta 1679 ページ: 65-73
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Pleurotolysin, a novel sphingomyelin-specific two-component cytolysin from the edible mushroom Pleurotus ostreatus, assembles into a transmembrane pore complex. (2004)
  • 著者名/発表者名: Tomita, T., Noguchi, K., Mimuro, H., Ukaji, F., Ito, K., Sugawara-Tomita, N., Hashimoto, Y.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 279 ページ: 26975-26982
• [雑誌論文] Protein sequence analysis, cloning and expression of flammutoxin, a pore-forming cytolysin from Flammulina velutipes : Maturation of dimeric precursor to monomeric active form by carboxyl-terminal truncation. (2004)
  • 著者名/発表者名: Tomita, T., Mizumachi, Y., Chong, K, Ogawa, Konishi, Sugawara, Tomita, N, Dohmae, N, Hashimoto Y, Takio, K.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 279 ページ: 54161-54172
• [雑誌論文] Cloning, expression, and pore-forming properties of mature and precursor forms of pleurotolysin, a sphingomyelin-specific two-component cytolysin from the edible mushroom Pleurotus ostreatus. (2004)
  • 著者名/発表者名: Sakurai, N., Kaneko, J., Kamio., Y., Tomita, T.
  • 雑誌名: Biochim.Biophys.Acta, 1679 ページ: 65-73
• [文献書誌] Ito, Y., Tomita, T., Roy, N., Sugawara-Tomita, N., Abe, N., Kamio, Y.: "Cloning, expression, and cell-surface localization of Paenibacillus sp.W-61 xylanase 5, a multidomain xylanase"Appl.Environ.Microbiol.. 69・12. 6969-6978 (2003)
• [文献書誌] Sawada, H., Umedo, M., Kawase, T., Baba, M., Tomita, T.: "Sythesis and properties of fluoroalkyl end-capped sulfobetaine polymers"J.Appl.Polym.Sci.. 92. 1144-1153 (2004)
• [文献書誌] Sawada, H., Kawase, T., Inaba, Y., Baba, M., Tomita, T.: "Synthesis of fluoroalkyl end-capped oligomers containing pendant phosphinic acid and phosphonic acid segments"International J.Polymeric Mater.. (in press). (2004)