| 研究課題/領域番号 |
15590404
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
細菌学(含真菌学)
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| 研究機関 | 岡山理科大学 |
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研究代表者 |
片山 誠一 岡山理科大学, 理学部, 講師 (70169473)
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| 研究分担者 |
松下 治 香川大学, 医学部, 助教授 (00209537)
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| 研究期間 (年度) |
2003 – 2004
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| 研究課題ステータス |
完了 (2004年度)
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| 配分額 *注記 |
3,600千円 (直接経費: 3,600千円)
2004年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
2003年度: 2,500千円 (直接経費: 2,500千円)
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| キーワード | Clostridium perfringens / ホスホリパーゼC / 転写調節 / phased A-tracts / bent DNA / RNAポリメラーゼ / αサブユニット / 共結晶化 / 共結晶 |
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| 研究概要 |
本研究の目的は、ウェルシュ菌α毒素(ホスホリパーゼC)遺伝子プロモーター上流のベントDNA (phased A-tracts)とRNAポリメラーゼ(RNAP)αサブユニット(315aa)がそのC末端ドメイン(αCTD,79aa)を介してどのように結合しているのか立体構造を明らかにすることである。そのためには、phased A-tracts DNA断片(33bp)とRNAPαサブユニットまたはαCTDとの共結晶が必要となる。まずウェルシュ菌RNAPαサブユニットとαCTDのN末端にHis-tagを付加し、大腸菌内で大量合成させ、His-tagを用いて精製した。両タンパク質とも結晶化できるほど精製できたが、最終精製量は、1リットル当たり数mgと少なく、結晶化に必要な50mgには及ばなかった。Joshua Sakon博士(米国:University of Arkansas)らとの討論で、phased A-tracts DNAとαサブユニットまたはαCTDの結合体が共結晶化できるほど低温(25℃)で安定した構造を保っているか調べる必要があることを指摘された。この問題点の解消や大量精製系の確立が進まず残念ながら結晶化までは至らなかった。Phased A-tractsとαCTDとの相互作用に関与するアミノ酸の同定するために、RNAP(α2、β、β'、σ)の再構成系の確立を試みた。封入体となったβ、β'サブユニットを尿素で、σ因子を塩酸グアニジンで可溶化し再構成すると、わずかながら転写活性がある標品が得られた。αサブユニットN末端ドメインを用いた時にも同様の活性が認められた。このことは、αCTDにアミノ酸置換を施した場合でも再構成が可能であることを示唆している。このRNAPの再構成法により、αCTDを介した転写調節メカニズムの研究が飛躍的に進展することが期待される。
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