研究課題
基盤研究(C)
我々は生体内に存在するADMAがNO産生の内因性阻害剤として働き、これを代表する酵素であるDDAHがNO産生制御系の鍵酵素になるという新説を導きだした。この事実から、動脈硬化症をはじめとするNO産生障害が原因となる病態の発症・進展のメカニズムを明らかにし、新しい予防・治療の概念を産み出すためにも生体内のADMA動態を詳細に評価しうるシステムの構築が重要な課題であると考えられる。このような観点に立って、本研究においては、ADMAの特異的かつ微量測定できる定量法の開発を行った。当初の計画において二つのシステムの開発をスタートさせた。一つは、DDAHの酵素反応を利用したシステム(システム1)であり、他の一つはADMAに対するモノクローナル抗体を作製して、これを利用した阻害ELISAによる定量法(システム2)を確立することである。システム1については、大量の酵素が必要となるため、大腸菌における発現系を構築し、その酵素学的性質において、native DDAHと同等の活性を有する精製rDDAHを(約2mg/培養液1L)得た。現在、これを用いた酵素反応による定量系を開発中である。一方、システム2はほぼ完成したと言える。即ち、ADMAに特異的、かつ親和性を有する有効なモノクローナル抗体が得られたことによって、これを用いた競合阻害ELISAの測定システムの構築はスムーズに進行し、まずスタンダードアッセイ系の確立が完了した。生体材料を用いる際には、検体中のタンパク質を除く目的で限外濾過の前処理を施し、測定感度を上げるためにMBSアシル誘導体化の操作を組み入れた。本処理段階における回収率も平均して95%を得た。次いで、本測定系の信頼性について検討した。従来より用いられてきたHPLCによる測定結果との相関性はきわめて高く(r=0.98)、その正確性が証明された。また、使用サンプル量として血漿1μlは十分量であり、本法を検査・診断方法として臨床現場にて応用する際にこの点が有効に働くものと考えられる。しかし、ヒト試験例数の少なさから、血漿ADMA濃度をこれら病態の診断基準に加える試みは未だなされていない。本測定キットの開発はヒト試験を容易に行える点において、動脈硬化症の新しい診断基準の導入、さらには新しい予防・治療法の開発へ貢献できるものと考える。
すべて 2005
すべて 雑誌論文 (10件)
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