| 研究課題/領域番号 |
15590623
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
消化器内科学
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
光井 洋 東京大学, 医学部附属病院, 助手 (30239280)
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| 研究分担者 |
丸山 稔之 東京大学, 大学院・医学系研究科, 講師 (30219571)
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| 研究期間 (年度) |
2003 – 2004
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| 研究課題ステータス |
完了 (2004年度)
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| 配分額 *注記 |
3,500千円 (直接経費: 3,500千円)
2004年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
2003年度: 2,400千円 (直接経費: 2,400千円)
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| キーワード | HCV / 受容体 |
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| 研究概要 |
HCV結合蛋白として報告されたヒトCD81をPCRでクローニングし、その組み換えベクターをCOS7細胞に導入し、G418による選択によって安定発現細胞株を作成した。得られたコロニーのうちCD81の発現量が多いものを選び(COS-CD81と命名)、以後のクローニングの実験に使用した。
ヒト肝臓cDNAに由来する発現ベクターライブラリー(大腸菌型)より、cDNA1万ずつの単位で大腸菌プレートを作成しプラスミドDNAを抽出した。このDNAプール36個、計36万の独立cDNAをスクリーニングの対象とした。LipofectionによりCOS-CD81細胞にcDNAを導入し、その後、培養上清に高タイターのHCV含有血清を加えた。48時間後に細胞からRNAを抽出し、高感度の多段階nested RT-PCRを用いてHCV-RNAの(-)鎖の増幅をおこなった。36プールのうち、6つの陽性プールが得られた。このうち1つのプールを600遺伝子ごとのサブプールに分割し、同様の導入・感染をおこないRNAを抽出、RT-PCRをおこなった。同様な5段階までのスクリーニングをおこなった結果、最終36個の独立クローンのうち8つの陽性クローンが得られた。しかし制限酵素処理などの結果からは、これらは8つとも異なるクローンの可能性が高く、現在のところ偽陽性である可能性が考えられている。その後、cDNAプールサイズを1/10程度にさげ、またRT-PCRにっいても特異陛がもっとも高いと報告されたTthポリメラーゼを用いた方法に変えて、再度スクリーニングをおこなっている。また発現ライブラリーをレトロウイルスに変えた系による方法も検討中である。
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