| 研究課題/領域番号 |
15591239
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
精神神経科学
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| 研究機関 | 札幌医科大学 |
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研究代表者 |
続 佳代 札幌医科大学, 医学部, 助手 (60207420)
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| 研究分担者 |
深津 亮 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (10113614)
木村 浩一 北海道立衛生研究所, 微生物細菌科, 科長 (90177915)
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| 研究期間 (年度) |
2003 – 2005
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| 研究課題ステータス |
完了 (2005年度)
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| 配分額 *注記 |
3,000千円 (直接経費: 3,000千円)
2005年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
2004年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
2003年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
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| キーワード | アルツハイマー病 / アミロイドβプロテイン / BACE / ネプリライシン / APP / BACE遺伝子 / 培養ヒト筋細胞 / クロロキンラット / アミロイドβタンパク / ノックアウト / アミロイドβ蛋白 / PCR / APP遺伝子 / 抗原賦活化処理 |
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| 研究概要 |
アルツハイマー病(AD)は脳のアミロイドβ蛋白(Aβ)沈着症と捉えることができることから、予防や治療には、脳内のAβ量を減少させることが必要である。Aβ量はAPPからAβを切り出す酵素(BACE)と産生されたAβをアミノ酸断片に分解する酵素ネプリライシン(NEP)によって決定される。本研究では、in vitroの実験モデルにおいて、BACEとNEPのAβ産生に与える影響について検討した。
1)APP強発現培養ヒト筋細胞に家族性ADの患者の変異APP遺伝子を導入し、APP強発現モデルを作成した。クロロキン添加により、細胞内の核周囲に空胞が見られるようになり、空胞内には顆粒状構造物が認められた。空胞はGomori-trichrome染色で赤色に染色された。
2)抗Aβ抗体による免疫染色によって、細胞質、核周囲の空胞が染色され、抗BACE抗体による二重染色においてその局在は一部の空胞、空胞内顆粒で一致した。
3)APP強発現培養ヒト筋細胞ホモジネートと各抗体によるWestern blottingの結果、抗Aβ抗体では70、60、28、20、12、4kDa、抗BACE抗体では70、40、35、20、12kDa、抗NEP抗体では80、70kDaバンドが検出された。
4)siRNA法でBACE遺伝子のノックアウト細胞を作成した。アンチセンス配列を結合させた二本鎖DNAを合成し、ベクターに組み込み、APP強発現培養ヒト筋細胞にトランスフェクトした。Northern ELISA法でAPPmRNAの発現量に変化はみられなかったが、BACEmRNAはBACE遺伝子をノックアウトしていない細胞に比べて50%程度減少した。免疫病理学的検討ではノックアウト前の細胞と比べると、劇的な変化は認められなかったが、抗Aβ抗体と抗BACE抗体の二重染色において、両抗体で局在の一致を示す空胞の数は減少した。
5)培養神経細胞よりNEPmRNAを抽出、増幅し、発現ベクターに組み込んだ。リポソーム法にてAPP強発現培養ヒト筋細胞にトランスフェクトした。現時点ではNEP量が有意に増加した組換え体が得られておらず、ベクターの変更も含めた検討を行っている。
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