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ヒト精子DNA傷害定量法開発とそれを指標としたDNA損傷精子排除法の確立

研究課題

研究課題/領域番号 15591781
研究種目

基盤研究(C)

配分区分補助金
応募区分一般
研究分野 産婦人科学
研究機関東京歯科大学

研究代表者

兼子 智  東京歯科大学, 歯学部, 講師 (40214457)

研究分担者 石川 博通  東京歯科大学, 歯学部, 教授 (60112679)
田辺 清男  東京歯科大学, 歯学部, 教授 (10101916)
研究期間 (年度) 2003 – 2004
研究課題ステータス 完了 (2004年度)
配分額 *注記
3,400千円 (直接経費: 3,400千円)
2004年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円)
2003年度: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
キーワードヒト精子 / DNA / DNA損傷 / 電気泳動 / 薄膜ゲル
研究概要

ヒト精子DNA損傷、特にDNA2重鎖切断の選択的観察法を開発した。個々の精子のDNA損傷を定量的に観察するため、single cell pulse gel field electrophoresis(SCPFGE)を開発した。装置は位相を90度ずらした2組の電極を有し、3秒インターバルで直交電場(2.0V/cm、10分間)を印加する。表面親水化処理したスライドグラス上に100μg/mlのアフィニティクロマトグラフィ精製トリプシンを含むアガロースに懸濁した細胞(30万/ml)を滴下し、薄膜ゲルを作成した。これを界面活性剤、トリプシン溶液に浸漬して、細胞融解、核蛋白の除去を行った。SCPFGEにより泳動を行うと、1.連続するDNAファイバーが原点から伸展する、2.DNAファイバーの先に断片化DNA、3.鎖長が異なるDNA断片が展開する、4.原点が消失し、高度断片のみを認める、など多様な像が得られた。これまで報告されたアルカリコメット法によるDNA断片化研究は、粒子状の断片化DNA像の有無でDNA損傷を判定していたが、ゲノムDNA(長鎖DNA)はアルカリ処理において、濃度依存性に断片化することが示され、アルカリコメット法はDNA断片化研究には不適であることが示唆された。これにより、本研究が開発したDNA2重鎖切断の選択的観察法とともに、DNA鎖の片側開裂の分別観察法の開発が必要であることが示された。
上述したSCPFGEにより射精精液を観察すると、DNA断片化像を呈する精子の比率は20-70%程度であった。本研究で開発した方法を指標としてDNA損傷精子の排除を試みた。Percollを密度勾配担体とする沈降速度差遠心分離法で精子を分離した後、オプチデンツを担体とする沈降平衡法を行うと、精子は2峰性に分布した。上層のDNA損傷比率は1%以下に低下したが、下層ではほとんどがDNA高度断片化像を示した。この結果はDNA損傷に伴い、細胞性状、特に密度が変化することが明らかとなった。上層の精子分画は運動率が高く、先体反応誘起能が高かった。本法により、DNA2重鎖切断精子を分離するという研究目的を達成できた。

報告書

(3件)
  • 2004 実績報告書   研究成果報告書概要
  • 2003 実績報告書
  • 研究成果

    (2件)

すべて 2004

すべて 雑誌論文 (2件)

  • [雑誌論文] Morphological abnormalities in the spermatozoa of fertile and infertile men2004

    • 著者名/発表者名
      M.Irie, K.Matsumiya, T.Iwamoto, K.Kaneko, S.Ishijima
    • 雑誌名

      Mol.Reprod.Dvelop. 70

      ページ: 70-81

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2004 研究成果報告書概要
  • [雑誌論文] Morphorogical abnormalities in the spermatozoa of fertile and infertile men2004

    • 著者名/発表者名
      M.Irie, K.Matsumiya, T.Iwamoto, K.Kaneko, S.Ishijima
    • 雑誌名

      Mol.Reprod.Dvelop. 70

      ページ: 70-81

    • 関連する報告書
      2004 実績報告書

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公開日: 2003-04-01   更新日: 2016-04-21  

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