マウス前脳虚血モデルの樹立とRNA干渉を用いた遺伝子導入マウスの作製および解析

• 研究課題/領域番号: 15650067
• 研究種目: 萌芽研究
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 神経解剖学・神経病理学
• 研究機関: (財)東京都医学研究機構
• 研究代表者: 芝崎 太 財団法人東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 副参事研究員 (90300954)
• 研究分担者: 加藤 裕之 財団法人東京都医学研究機構, 研究員 (30301732) ; 内野 博之 東京医科大学, 八王子医療センター・麻酔科, 講師 (60266476)
• 研究期間 (年度): 2004
• 研究課題ステータス: 完了 (2004年度)
• 配分額: 2,800千円 (直接経費: 2,800千円); 2004年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円); 2003年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
• キーワード: 免疫抑制剤 / 虚血 / カルシニューリン / 遺伝子改変動物 / RNA干渉 / カルシウム / 前脳虚血モデル

研究概要

(1)マウス前脳虚血モデルの樹立
これまで、マウスの前脳虚血モデルを樹立するため様々な検討を行ってきた。本研究では、温度管理のため手術野および手術用顕微鏡をアクリルボードで覆い、全体を37℃に保てるシステムを構築した。さらにはマウス個体間や手術手技自体の誤差をなくすため、赤外線脳血流計を用いて虚血効果を定量化した。これによりさらに虚血の正確性が増した。
(2)カルシニューリン活性により制御されるNCX受容体の機能解析
海馬のスライスを用いたin vitroの実験系において、CsAおよびFK506の投与により、低酸素刺激による細胞内カルシウム上昇がきわめて効果的に抑制できることが判明した(東京薬科大学、工藤佳久教授との共同研究)。これらの薬剤の共通のターゲットであるカルシニューリンが、カルシウム受容体(細胞膜、または細胞内)を制御していることを示している。現在、遅発性に起こる細胞内カルシウム上昇がNa/Ca exchange transporter(NCX)受容体、特にNCX2受容体がカルシニューリンにより制御されていることが判明しているが。本研究では、虚血による細胞内カルシウムの上昇にこのNCX2受容体が重要な役割を果たしていることが予想されたため、まず、NCXの各サブタイプの抗体を用いて虚血ラット海馬におけるNCXを調べた。NCX1および2は虚血後12-24時間で海馬神経細胞に発現の上昇がみられた。次に、カルシニューリンを含むこれらの遺伝子に対してsiRNAを作製した。まず、カルシニューリンに対するsiRNAは6種類のうち2種類がサブタイプ別に効率よくカルシニューリンを抑制した。さらにNCXに関しては現在作製中である。今後はこれらのsiRNAを用いて培養細胞や遺伝子改変動物(ノックダウンマウス)を作製しさらに解析を進める予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Potent neuroprotection of CsA by inhibiting pathways involving calcinenum and cyclophilin D in forebrain ischemia. (2005)
  • 著者名/発表者名: Shibasaki, F, Uchino, H., Kristian, T., Perkins, G., Ishii, N., Siesio, B.K.
  • 雑誌名: Pharmacology of Cerebral Ischemia(Medpharm Scientific Publisher Stuttgart) ページ: 453-465
• [雑誌論文] Bcl-2 phosphorylation precedes caspases-3 activation and cell death after neonatal cerebral hypoxia-ischemic injury (2005)
  • 著者名/発表者名: Hallin, U., Kondo, E., Shibasaki, F., Blomgren, K.
  • 雑誌名: Neuroscience (in press)
• [雑誌論文] Calcium Signal-induced Coffilin Dephosphorylation is Mediated by Slingshot via Calcineurin. (2005)
  • 著者名/発表者名: Wang, Y., Shibasaki, F., Niwa, R., Uemura, T., Mizuno, K.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. (in press)
• [雑誌論文] Gα12/13-mediated production of reactive oxygen speicies is critical for angiotensin II receptor-induced NFAT activation in cardiac fibroblasts. (2005)
  • 著者名/発表者名: Fujii, T., Onohara, N., Fukutomi, M., Nagamatsu, Y., Naruyama, Y., Kobayashi, H., Inoue, R., Sugimoto, H., Shibasaki, F., Nagao, T., Nishida, M., Kurose, H
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. (in press)
• [雑誌論文] T細胞アレルギーによる免疫制御 (2005)
  • 著者名/発表者名: 芝崎 太
  • 雑誌名: 日本臨床 (In press)
• [雑誌論文] 脳蘇生における薬物療法 (2005)
  • 著者名/発表者名: 内野博之, 芝崎 太, 石井脩夫
  • 雑誌名: 蘇生 (In press)
  • NAID: 10013501306
• [雑誌論文] Calcineurin inhibits Na^+/Ca^<2+> exchange in phenylephrine-treated hypertrophic cardiomyocytes. (2004)
  • 著者名/発表者名: Yuki Katanosaka, Yuko Iwata, Yuko Kobayashi, Futoshi Shibasaki, Shigeo Wakabayashi, Munekazu Shigekawa
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 280 ページ: 5764-5772
• [雑誌論文] Histon deacetylase 7 associates with hypoxia- inducible factor 1 alpha and regulate transcriptional activity. (2004)
  • 著者名/発表者名: Kato H, Tamamizu-Kato S, Shibasaki F
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 274 ページ: 41966-41974
• [雑誌論文] Activation of the CKI-CDK-Rb-E2F pathway in full genome hepatitis C virus-expressing cells. (2004)
  • 著者名/発表者名: Tsukiyama-Kohara K, Tone S, Maruyama I, Inoue K, Katsume A, Nuriya H, Ohmori H, Ohkawa J, Taira K, Hoshikawa Y, Shibasaki F. et al.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 279 ページ: 14531-14541
• [雑誌論文] Calcineurin and cyclophilin D are differential targets of neuroprotection by immunosuppressants CsA and FK506 in ischemic brain damage. (2004)
  • 著者名/発表者名: Uchino H, Ishii N, Shibasaki F
  • 雑誌名: Acta Neurochir Suppl. 86 ページ: 105-111
• [雑誌論文] 日本のTRCの現状と展望 (2004)
  • 著者名/発表者名: 芝崎 太
  • 雑誌名: Medichem News 14 ページ: 7-11
• [雑誌論文] eTagによる癌治療効果予測 (2004)
  • 著者名/発表者名: Sharat Singh, 戸井雅和, 芝崎 太
  • 雑誌名: 細胞 36 ページ: 31-35
• [雑誌論文] 新規同時他項目アッセイシステムeTagの応用 (2004)
  • 著者名/発表者名: 芝崎 太
  • 雑誌名: バイオベンチャー 18 ページ: 38-40
• [雑誌論文] 虚血性神経細胞死の分子機序と薬物療法による脳保護の可能性 (2004)
  • 著者名/発表者名: 内野博之, 芝崎 太, 石井脩夫
  • 雑誌名: Life support and Anesthesia 11 ページ: 1-18
• [雑誌論文] 虚血による神経細胞死とカルシニューリン、シクロフィリン (2004)
  • 著者名/発表者名: 内野博之, 芝崎 太, 石井脩夫
  • 雑誌名: Biotherapy 18 ページ: 115-127
• [雑誌論文] ミトコンドリア膜透過性に対するシクロスポリンの作用 (2004)
  • 著者名/発表者名: 芝崎 太, 内野博之
  • 雑誌名: 医薬ジャーナル 40 ページ: 172-177
• [雑誌論文] ミトコンドリア膜透過性に対するシクロスポリンの作用。特集:シクロスポリンの作用〜解明された多様性〜 (2004)
  • 著者名/発表者名: 芝崎 太, 内野博之
  • 雑誌名: 医薬ジャーナル特集号 ページ: 30-35
• [雑誌論文] 特集「病態とアポトーシス」虚血による神経細胞死とカルシウム・カルシニューリン (2004)
  • 著者名/発表者名: 芝崎 太, 内野博之
  • 雑誌名: Biotherapy 18 ページ: 23-26
• [雑誌論文] 「脳を守るための戦略」虚血性神経細胞死の分子機序と薬物療法による脳保護の可能性 (2004)
  • 著者名/発表者名: 内野博之, 芝崎 太, 石井脩夫
  • 雑誌名: Lisa 11 ページ: 114-117
• [文献書誌] Tomida T, Hirose K, Takizawa A, Shibasaki F, Iino M: "NFAT functions as a working memory of Ca2+ signals in decoding Ca2^+ oscillation"EMBO J.. 22. 3825-3832 (2003)
• [文献書誌] 内野博之, 芝崎 太, 石井脩夫: "「脳を守るための戦略」虚血性神経細胞死の分子機序と薬物療法による脳保護の可能性について"Lisa. 11. 114-117 (2004)
• [文献書誌] 芝崎 太, 内田和代: "新規同時他項目アッセイシステムeTagの応用"バイオベンチャー. 18. 38-40 (2004)
• [文献書誌] 芝崎 太, 内野博之: "特集「病態とアポトーシス」虚血による神経細胞死とカルシウム・カルシニューリン"Biotherapy. 18. 23-26 (2004)
• [文献書誌] 内野博之, 芝崎 太, 石井脩夫: "虚血性神経細胞死におけるカルシニューリンの役割"臨床検査(医学書院). 12-18 (2003)