ディスプレイクローニングと計算科学による結合タンパク質の戦略的決定

• 研究課題/領域番号: 15651101
• 研究種目: 萌芽研究
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 生物分子科学
• 研究機関: 東京理科大学
• 研究代表者: 菅原 二三男 東京理科大学, 理工学部, 教授 (30192123)
• 研究期間 (年度): 2003 – 2004
• 研究課題ステータス: 完了 (2004年度)
• 配分額: 3,400千円 (直接経費: 3,400千円); 2004年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円); 2003年度: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
• キーワード: ジベレリン / ジベレリン結合タンパク / ファージディスプレイ法 / Ipha-exansin2 / nodulin / イネ(Orza sativa) / 培養細胞ライブラリ / 出芽組織ライブラリ / ZD1839 / イレッサ / ファージディスプレイ / カンプトテシン / IGF-1R / EGFR

研究概要

植物ホルモン,ジベレリンの結合タンパク質を決定するため,イネcDNAをファージに組み込み,ディスプレイクローニング法によりジベレリン結合タンパク(gibberellin binding Protein : GBP)の決定を試みた。
ビオチン化GA4)をリガンドとし,イネ(Oryza sativa)の培養細胞及び出芽組織(発芽3日目,7日目)から作成したT7ファージライブラリをファージディスプレイ法でスクリーニングした。ファージとビオチン化GA4の結合を,再度ファージディスプレイ法を用いて確かめると,培養細胞ライブラリ由来の1種,出芽組織ライブラリ由来の2種のファージで結合が見られた。これら3種のファージが提示しているアミノ酸配列をDNA配列から推測すると,それぞれ,培養細胞ライブラリ由来ファージは17残基,出芽組織ライブラリ由来ファージは5残基及び10残基のペプチドを提示していた。ファージディスプレイ法で結合の最も強く見られた,培養細胞ライブラリ由来の17残基のペプチドを表面プラズモン共鳴によって結合解析をした結果,センサーチップ上に固定したペプチドとジベレリンA4の結合が確認された。この3種のペプチドのアミノ酸配列を,遺伝子データベースで検索すると,5残基で構成されるペプチド1種について,alpha-expansin2及び,nodulinと相同性が見られた。alpha-expansin2及び,nodulinをクローニングしてタンパク質を得,表面プラズモン共鳴センサーにより生体分子相互作用解析を試みようとした。しかしながら,当該遺伝子は大腸菌では全く発現しなかった。そこで,無細胞タンパク質発現系なども試みたが,事態は全く改善されていない。今後ファージディスプレイを改変した結合解析法を開発しているので,その方法を適用する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Mammalian mitotic centromere-associated kinesin (MCAK), a new molecular target of sulfoquinovosylacylglycerols (SQAGs), novel anti-tumor and immunosuppressive agents (2005)
  • 著者名/発表者名: Aoki S, Kamisuki S, Ohta S, Sugawara F, Sakaguchi K
  • 雑誌名: FEBS J. (In press)
• [雑誌論文] Monolayer membranes and bilayer vesicles characterized by α- and β-anomer of sulfoquinovosyldiacyglycerol (SQDG). (2005)
  • 著者名/発表者名: Matsumoto.K, Sakai H, Ohta K, Kameda H, Sugawara F, Abe M, Sakaguchi K.
  • 雑誌名: Chemistry and Physics of Lipids. (In press)
• [雑誌論文] Affinity capture of a mammalian DNA polymerase β by inhibitors immobilized to resins used in solid-phase organic synthesis. (2005)
  • 著者名/発表者名: Kuramochi K, Haruyama Y, Takeuchi R, Sunoki T, Watanabe M, Oshige M, Kobayashi S, Sakaguchi K, Sugawara F
  • 雑誌名: Bioconjugate Chemistry. 16:97 ページ: 97-104
• [雑誌論文] Identification of a drug target motif : an anti-tumor drug NK109 interacts with a PNxxxxP motif (2005)
  • 著者名/発表者名: Kengo Morohashi, Ayako Yoshino, Atsushi Yoshimori, Seiichi Saito, Seiichi Tanuma, Kengo Sakaguchi, Fumio Sugawara
  • 雑誌名: Biochem.Pharmacol. (In press)
• [雑誌論文] hEP1 Receptor Third Cytoplasmic Loop : A New Target for Camptothecin Identified by Phage Display Technology (2005)
  • 著者名/発表者名: Yoichi Takakusagi, Keisuke Ohta, Kouji Kuramochi, Kengo Morohashi, Susumu Kobayashi, Kengo Sakaguchi, Fumio Sugawara
  • 雑誌名: Biochemistry (In press)
• [雑誌論文] Design of vesicles of 1,2-di-O-acyl-3-O-(beta-D-sulfoquinovosyl)-glyceride bearing two stearic acids (beta SQDG-C(18)), a novel immunosuppressive drug. (2004)
  • 著者名/発表者名: Matsumoto K, Takenouchi M, Ohta K, Ohta Y, Imura T, Oshige M, Yamamoto Y, Sahara H, Sakai H, Abe M.
  • 雑誌名: Biochem Pharmacol. 68 ページ: 2379-2386
• [雑誌論文] Synthesis of an immunosuppressant SQAG9 and determination of the binding peptide by T7 phage display. (2004)
  • 著者名/発表者名: Yamazaki T, Aoki S, Ohta K, Hyuma S, Sakaguchi K, Sugawara F.
  • 雑誌名: Bioorg.Med.Chem.Lett. 14 ページ: 4343-4346
• [雑誌論文] Structural relationship of lithocholic acid derivatives binding to the N-terminal 8-kDa domain of DNA polymerase beta. (2004)
  • 著者名/発表者名: Miura K, Hanashima S, Takemura M, Yoshida H, Sugawara F, Sakaguchi K.
  • 雑誌名: Biochemistry 43 ページ: 10669-10677
• [雑誌論文] Precise structural elucidation of dehydroaltenusin, a specific inhibitor of mammalian DNA polymerase alpha (2004)
  • 著者名/発表者名: Kamisuki S, Takahashi S, Mizushina Y, Sakaguchi K, Nakata T, Sugawara F
  • 雑誌名: Bloorg.Med.Chem 12 ページ: 5355-5359
• [雑誌論文] Molecular design of cholesterols as inhibitors of DNA polymerase alpha. (2004)
  • 著者名/発表者名: Oshige M, Kuramochi K, Ohta K, Ogawa A, Kuriyama H, Sugawara F, Kobayashi S, Sakaeuchi K
  • 雑誌名: J.Med.Chem. 47 ページ: 4971-4974
• [雑誌論文] Structure-activity relationships of epolactaene analogs as DNA polymerases inhibitors. (2004)
  • 著者名/発表者名: Kuramochi K, Mizushina Y, Nagata S, Sugawara F, Sakaguchi K, Kobayashi S.
  • 雑誌名: Bloorg.Med.Chem. 12 ページ: 1983-1989
• [雑誌論文] Structure-activity relationships of untenone A and its derivatives for inhibition of DNA polymerases (2004)
  • 著者名/発表者名: Saito F, Takeuchi R, Kamino T, Kuramochi K, Sugawara F, Sakaguchi K, Kobayashi S.
  • 雑誌名: Bloorg.Med.Chem.Lett. 14 ページ: 1975-1977
• [雑誌論文] Protective properties of neoechinulin A against SIN-1-induced neuronal cell death. (2004)
  • 著者名/発表者名: Maruyama K, Ohuchi T, Yoshida K, Shibata Y, Sugawara F, Arai T.
  • 雑誌名: J.Biochem.(Tokyo) 36 ページ: 81-87
  • NAID: 10016200897
• [雑誌論文] Synthetic sulfonolipids deduced from sulfonoquinovosyl diacylglycerols of sea urchin reduces hepatic ischemia-reperfusion injury in rats. (2004)
  • 著者名/発表者名: Tsuruma T, Sahara H, Takenouchi M, Yagihashi A, Iwayama Y, Shima H, Furuhata T, Torigoe T, Hanashima S, Yamazaki T, Sugawara F, Mizushina Y, Ohta K, Sakaguchi K, Sato N, Hirata K.
  • 雑誌名: Transplant Proc 36 ページ: 1965-1969
• [雑誌論文] The effects of dehydroaltenusin, a novel mammalian DNA polymerase alpha inhibitor, on cell proliferation and cell cycle progression. (2004)
  • 著者名/発表者名: Murakami-Nakai C, Maeda N, Yonezawa Y, Kuriyama I, Kamisuki S, Takahashi S, Sugawara F, Yoshida H, Sakaguchi K, Mizushina Y.
  • 雑誌名: Biochim.Biophys.Acta. 1674 ページ: 193-199
• [雑誌論文] Pseudodeflectusin, a novel isochroman derivative from Aspergillus pseudodeflectus a parasite of the sea weed, Sargassum fusiform, as a selective human cancer cytotoxin (2004)
  • 著者名/発表者名: Ogawa A, Murakami C, Kamisuki S, Kuriyama I, Yoshida H, Sugawara F, Mizushina Y.
  • 雑誌名: Bioorg.Med.Chem.Lett. 14 ページ: 3539-3543
• [雑誌論文] Taxol derivatives are selective inhibitors of DNA polymerase alpha. (2004)
  • 著者名/発表者名: Oshige M, Takenouchi M, Kato Y, Kamisuki S, Takeuchi T, Kuramochi K, Shiina I, Suenaga Y, Kawakita Y, Kuroda K, Sato N, Kobayashi S, Sugawara F, Sakaguchi K.
  • 雑誌名: Bioorg.Med.Chem. 12 ページ: 2597-2601
• [産業財産権] 新規イソクロマノン化合物とその行為丸剤への利用 (2004)
  • 発明者名: 菅原 二三男, 水品 善之 他
  • 権利者名: 東京理科大学
  • 出願年月日: 2004-04-19
• [産業財産権] 新規な放射線治療増感剤 (2004)
  • 発明者名: 菅原 二三男, 山崎 隆之 他
  • 権利者名: 東京理科大学
  • 出願年月日: 2004-06-24
• [産業財産権] Administration of a sulfopyranosylacylglycerol to treat certain cancer (2004)
  • 発明者名: 菅原 二三男, 山崎 隆之 他
  • 権利者名: 東洋水産(株)
  • 取得年月日: 2004-08-03
• [文献書誌] Mizushina Y, Maeda N, Kawasaki M, Ichikawa H, Murakami C, Takemura M, Xu X, Sugawara F, Fukumori Y, Yoshida H, Sakaguchi K.: "Inhibitory action of emulsified sulfoquinovosyl acylglycerol on mammalian DNA polymerases."Lipids. 33. 1065-1074 (2003)
• [文献書誌] Mizushina Y, Hirota M, Murakami C, Ishidoh T, Kamisuki S, Shimazaki N, Takemura M, Perpelescu M, Suzuki M, Yoshida H, Sugawara F, Koiwai O, Sakaguchi K.: "Some anti-chronic inflammatory compounds are DNA polymerase lambda-specific inhibitors."Biochem.Pharmacol.. 66. 1935-1944 (2003)
• [文献書誌] Kimura S, Furukawa T, Kasai N, Mori Y, Kitamoto HK, Sugawara F, Hashimoto J, Sakaguchi K.: "Functional characterization of two flap endonuclease-1 homologues in rice."Gene. 314. 63-71 (2003)
• [文献書誌] Murakami C, Takemura M, Yoshida H, Sugawara F, Sakaguchi K, Mizushina Y.: "Analysis of cell cycle regulation by 1-mono-O-acyl-3-O-(alpha-D-sulfoquinovosyl)-glyceride (SQMG), an inhibitor of eukaryotic DNA polymerases."Biochem.Pharmacol.. 66. 541-550 (2003)
• [文献書誌] Namekawa S, Ichijima Y, Hamada F, Kasai N, Iwabata K, Nara T, Teraoka H, Sugawara F, Sakaguchi K.: "DNA ligase IV from a basidiomycete, Coprinus cinereus, and its expression during meiosis."Microbiology. 149. 2119-2128 (2003)
• [文献書誌] Mizushina Y, Murakami C, Takikawa H, Kasai N, Xu X, Mori K, Oshige M, Yamaguchi T, Saneyoshi M, Shimazaki N, Koiwai O, Yoshida H, Sugawara F, Sakaguchi K.: "Molecular action mode of Hippospongic acid A, an inhibitor of gastrulation of starfish embryos."Biochem.Biophys.Res.Commun.. 305. 365-373 (2003)