マウス遺伝子改変の高効率化:ターゲティングベクターの正確かつ迅速な構築法

• 研究課題/領域番号: 15657041
• 研究種目: 萌芽研究
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 分子生物学
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 和田 洋 大阪大学, 産業科学研究所, 助教授 (50212329)
• 研究期間 (年度): 2003 – 2004
• 研究課題ステータス: 完了 (2004年度)
• 配分額: 3,400千円 (直接経費: 3,400千円); 2004年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円); 2003年度: 1,900千円 (直接経費: 1,900千円)
• キーワード: 遺伝子改変動物 / 形質転換 / オルガネラ / ノックアウトマウス / 相同組換え / ES細胞 / トランスジェニックマウス / ターゲティングベクター / 大腸菌人工染色体

研究概要

遺伝子改変マウスの作出は,複雑なin vitroでの遺伝子操作,ES細胞の培養,そして胚操作による個体の作出など,多数のステップからなる長期の綿密な実験を必要とする.本研究では大腸菌内相同組換え法を導入することにより,BACクローン上で迅速に遺伝子改変を進める遺伝子構築技術を確立する.このため,セレクションマーカとしてジフテリア毒素Aフラグメントを発現するベクターを改変し,Srf I, Pme Iなどのrare restriction siteを組込み、ES細胞に導入する際に直鎖化するのに便利なプラスミド,pBSDT-AIIを作成した.次に,ES細胞内駆動用PGK promoterと大腸菌内用EM7 promoterのキメラプロモータを使用し,さらにはES細胞内でNeoを選択的に除去できるようにするため,flp recombinaseの認識サイトとlox Pを両端にもつ遺伝子カセットをもつプラスミド,pGPS21loxFRTNeoを作成した.このカセットを実際にES細胞内に形成導入した結果,ES細胞にG418耐性を付与することが示された.さらに第三のlox Pを挿入するため,pMODloxZeoDAmp-3を構築した.このplasmidはTn5のtranspositionに必須な領域に挟まれた形でloxP-Zeo-loxPカセットを有しており,試験管内での反応により,カセットを任意のDNAに挿入することができる.これらの遺伝子モジュールを用いてmVam2, V-ATPase a3について遺伝子破壊を進め、キメラマウスの作出と遺伝子破壊マウスの作成に成功した.本手法の導入によって多細胞生物の遺伝子変換の最初のステップをきわめて効率化・迅速化することができた.

研究成果

• [雑誌論文] Simple and straightforward construction of a mouse gene targeting vector using in vitro transposition reaction (2005)
  • 著者名/発表者名: M.Aoyama et al.
  • 雑誌名: Nucleic Acids Res. (印刷中)
• [雑誌論文] Diverse and essential roles pf mammalian vacuolar-type proton ATPase : toward the physiological understanding of inside acidic compartments (2004)
  • 著者名/発表者名: G.-H.Sunwada et al.
  • 雑誌名: Biochim Biophys Acta 1658 ページ: 106-114
• [雑誌論文] Regulatory elements directing gut expression of the GATA6 gene during mouse early development (2004)
  • 著者名/発表者名: G.-H.Sunwada et al.
  • 雑誌名: J Biochem 135 ページ: 165-169
• [雑誌論文] Proton pumping ATPases and diverse inside-acidic compartments. (2004)
  • 著者名/発表者名: Futai M et al.
  • 雑誌名: Yakugaku Zasshi 1245 ページ: 243-250
• [雑誌論文] Proton translocating ATPases : introducting unique enzymes coupling catalysis and proton translocation through mechanical rotation (2004)
  • 著者名/発表者名: Futai M.et al.
  • 雑誌名: Handbook of ATPases : Biochemistry, Cell Biology.Pathophysiology ページ: 237-256
• [雑誌論文] Vacuolar-type proton ATPases : subunit isoforms and tissue-specific function (2004)
  • 著者名/発表者名: G.-H.Sun-wada et al.
  • 雑誌名: Handbook of ATPases : Biochemistry, Cell Biology, Pathophysiology ページ: 379-392
• [文献書誌] Sun-Wada, G.H.et al.: "Mouse proton pump ATPase C subunit isoforms (C2-a and C2-b) specifically expressed in kidney and lung"J.Biol.Chem.. 278. 44843-44851 (2003)
• [文献書誌] Suzuki, J.et al.: "Involvement of syntaxin 7 in human gastric epithelial cell vacuolation induced by the Helicobacter pylori-produced cytotoxin VacA."J.Biol.Chem.. 278. 25585-25590 (2003)
• [文献書誌] Toyomura, T.et al.: "From lysosomes to plasma membrane : Localization of vacuolar type H^+-ATPase with the a3 isoform during osteoclast differentiation."J.Biol.Chem.. 278. 22023-22030 (2003)
• [文献書誌] Sun-Wada, G.H.et al.: "Diversity of mouse proton-translocating ATPase : presence of multiple isoforms of the C, d and G subunits."Gene. 302. 147-153 (2003)
• [文献書誌] Hirata, T.et al.: "Subunit rotation of vacuolar-type proton pumping ATPase : Relative rotation of the G as to c subunit"J.Biol.Chem.. 278. 23714-23719 (2003)
• [文献書誌] Sun-Wada, G.-H.et al.: "Lysosome and lysosome-related organelles responsible for specialized functions in higher organisms, with special emphasis on vacuolar-type proton ATPase."Cell Struct.Funct. 28. 455-463 (2003)