| 研究課題/領域番号 |
15658032
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| 研究種目 |
萌芽研究
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
応用生物化学
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
林 隆久 京都大学, 生存圏研究所, 助教授 (70231529)
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| 研究期間 (年度) |
2003 – 2004
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| 研究課題ステータス |
完了 (2004年度)
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| 配分額 *注記 |
3,100千円 (直接経費: 3,100千円)
2004年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
2003年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
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| キーワード | セルラーゼ / ミクロフィブリル / UDP-グルコース / セロオリゴサッカライド / Outer membrane |
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| 研究概要 |
セルロース合成菌(Acetobacter xylinum)の膜画分をUDP-[^<14>C]グルコースとインキュベートすることにより、ビトロでのセルロース合成を試みた。セルラーゼ遺伝子が破壊された変異株は、野生株に対して、約3分の1の合成量を示すことが認められた。合成酵素反応系にリコンビナントセルラーゼを加えて取り込みをみたところ、約2倍量の増加が認められた。この反応物を電気泳動に供したところ、Nativeゲルでも、[^<14>C]グルコースの取り込みとウェスタンブロットによるセルラーゼの挙動は一致していた。このことから、セルラーゼがセルロース生合成のプライマーとして機能していることが示された。次に、UDP-[^<14>C]グルコースからセルロースを合成して反応生成物をSDS/PAGEに供した。^<14>Cラベルはオートラジオグラフィで、セルラーゼはウェスタンブロットで検出した。その結果、一部のラベル(反応生成物)はゲルの中に入った。反応液中にセルラーゼを添加すると、ラベルがセルラーゼ(46kDa)と同じ挙動を示した。すなわち、セルラーゼが[^<14>C]グルコースでラベルされることを発見した。セルラーゼのシグナルがスミヤーになることから、グルコース部分は重合度が高いことが推察された。現在、最適条件でリコンビナントセルラーゼをプライマーとして初発反応を行い、反応生成物(セロオリゴ糖/セルラーゼ複合体)を抗体カラムによって単離するとともに、得られた複合体をゲルろ過カラム及び電気泳動に供してセルラーゼとセロオリゴ糖が同じ挙動であることを示し、セロオリゴ糖の重合度をメチル化分析によって決定している。
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