β_2-mアミロイド線維形成の阻害物質の探索

• 研究課題/領域番号: 15659202
• 研究種目: 萌芽研究
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 腎臓内科学
• 研究機関: 新潟大学
• 研究代表者: 下条 文武 新潟大学, 医歯学総合病院, 教授 (20126410)
• 研究分担者: 斉藤 亮彦 (斎藤 亮彦) 新潟大学, 大学院・医歯学総合研究科, 客員助教授 (80293207)
• 研究期間 (年度): 2003 – 2005
• 研究課題ステータス: 完了 (2005年度)
• 配分額: 3,300千円 (直接経費: 3,300千円); 2005年度: 500千円 (直接経費: 500千円); 2004年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円); 2003年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
• キーワード: β_2-ミクログロブリン / 透析アミロードシス / アミロイド線維 / メガリン / AGE / LFABP / 水晶発振子マイクロバランス法 / 遺伝子発現 / ドデシル硫酸ナトリウム / トリフルオロエタノール / レプチン / L-FABP / MIF / グリコサミノグリカン / プロテオグリカン / アミロイド線維伸長反応 / 細胞移植

研究概要

本年度は、β_2-ミクログロブリン(β_2-m)アミロイド線維伸張反応のin vitro解析系(チオフラビンT法)を用いて、線維形成の分子機構とその阻害分子を解析する(論文1-4)とともに、アミロイド線維伸張反応の新しい解析系として、水晶発振子マイクロバランス法(Affinix Q)を用いる方法を検討した。これは水晶発振子センサーチップに断片化されたβ_2-mアミロイド線維を固定化し、それに対してリコンビナントβ_2-mを反応させて起こる重合反応を、水晶発振子の振動数変化として検知する系である。この系は、微量な試料を用いて定性的・定量的結合反応を高感度に評価できる利点がある。今年度、私たちは、その系におけるβ_2-mアミロイド線維形成反応および反応阻害実験の至適条件の設定を行った。
さらに今年度、私たちは、β_2-mを細胞内に取り込み代謝するエンドサイトーシス受容体メガリンの分子機能に検討を加え、advanced glycation endproducts(AGE)との直接の結合性を、水晶発振子マイクロバランス法を用いて証明した(論文5)。さらに、メガリンが肝型脂肪酸結合蛋白(liver-type fatty acid binding protein, LFABP)と結合し、その細胞内取り込みと代謝に関わることを明らかにした(論文6)。このような多面的な機能を有するメガリン分子の作用メカニズムを明らかにすることが、β_2-mアミロイド線維形成の阻害に有益であると考えられる。そこで私たちは、メガリンの巨大遺伝子を細胞内で発現させ、その機能ドメインを同定する研究を行った。既に、全長遺伝子を一過性に発現・機能させることに成功しており、部分的な遺伝子発現を行った場合との比較を行うとともに、定常的発現細胞の樹立を進めている。

研究成果

• [雑誌論文] Aβ-2M-amyloidosis and related bone diseases. (2006)
  • 著者名/発表者名: Kazama JJ, Yamamoto S, Takahashi N, Ito Y, Maruyama H, Narita I, Gejyo F
  • 雑誌名: J Bone Miner Metab 24(2) ページ: 182-184
• [雑誌論文] Historical background and clinical treatment of dialysis-related amyloidosis. (2005)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto S, Gejyo F
  • 雑誌名: Biochim Biophys Acta. 1753(1) ページ: 4-10
• [雑誌論文] Molecular interactions in the formation and deposition of β2-microglobulin-related amyloid fibrils. (2005)
  • 著者名/発表者名: Naiki H, Yamamoto S, Hasegawa K, Yamaguchi I, Goto Y, Gejyo F
  • 雑誌名: Amyloid 12(1) ページ: 15-25
• [雑誌論文] Significance of proximal tubular metabolism of advanced glycation end products in kidney diseases. (2005)
  • 著者名/発表者名: Saito A, Takeda T, Sato K, Hama H, Tanuma A, Kaseda R, Suzuki Y, Gejyo F
  • 雑誌名: Ann NY Acad Sci. 1043 ページ: 637-643
• [雑誌論文] Evidence for megalin-mediated proximal tubular uptake of L-FABP, a carrier of potentially nephrotoxic molecules. (2005)
  • 著者名/発表者名: Oyama Y, Takeda T, Hama H, Tanuma A, Hino N, Sato K, Kaseda R, Ma M, Yamamoto T, Fujii H, Kazama JJ, Odani S, Terada Y, Mizuta K, Gejyo F, Saito A
  • 雑誌名: Lab Invest. 85(4) ページ: 522-531
• [雑誌論文] Kinetic analysis of the polymerization and depolymerization of β(2)-microglobulin-related amyloid fibrils in vitro. (2005)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto S, Hasegawa K, Yamaguchi I, Goto Y, Gejyo F, Naiki H
  • 雑誌名: Biochim Biophys Acta. 1753(1) ページ: 34-43
• [雑誌論文] Evidence for megalin-mediated proximal tubular uptake of L-FABP, a carrier of potentially nephrotoxic molecules. (2005)
  • 著者名/発表者名: Oyama Y, et al.
  • 雑誌名: Lab Invest (In press)
• [雑誌論文] Glycosaminoglycans enhance the trifluoroethano 1-induced extension of β2-microglobulin-related amyloid fibrils at a neutral PH. (2004)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto S, et al.
  • 雑誌名: J Am Soc Nephrol 15 ページ: 126-133
• [雑誌論文] Low concentrations of sodium dodecyl sulfate induce the extension of beta2-microglobulin-related amyloid fibrils at a neutral pH. (2004)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto S, et al.
  • 雑誌名: Biochemistry 43 ページ: 11075-11082
• [雑誌論文] The role of macrophage migration inhibitory factor(MIF) in β2-microglobulin (β2M) amyloidosis. (2004)
  • 著者名/発表者名: Saito N, et al.
  • 雑誌名: J Am Soc Nephrol 15
• [雑誌論文] Differentiation-induced cultured podocytes express endocytically active megalin, a Heymann nephritis antigen. (2004)
  • 著者名/発表者名: Yamazaki H, et al.
  • 雑誌名: Nephron Exp Nephrol 96 ページ: 52-58
• [雑誌論文] Evidence indicating that renal tubular metabolism of leptin is mediated by megalin but not by the leptin receptors. (2004)
  • 著者名/発表者名: Hama H, et al.
  • 雑誌名: Endocrinology 145 ページ: 3935-3940
• [図書] AGEs研究の最前線 -糖化蛋白疾患研究の現状- (2004)
  • 著者名/発表者名: 斎藤 亮彦, 他
  • 総ページ数: 7
• [文献書誌] Yamaguchi I,...Gejyo F,...et al.: "Glycosaminoglycan and proteoglycan inhibit the depolymerization of β_2-microglobulin amyloid fibrils in vitro."Kidney International. 64. 1080-1088 (2003)
• [文献書誌] Hasegawa K,...Gejyo F,...et al.: "Amyloidogenic synthetic peptide of/β_2-microglobulin-a role of the disulfide bond."Biochem Biophys Res Commun. 304. 101-106 (2003)
• [文献書誌] Saito A,...Gejyo F,...et al.: "Role of megalin in endocytosis of advanced glycation end products : implications for a novel protein binding to both megalin and advanced glycation end products."Journal of American Society of Nephrology. 14. 1123-1131 (2003)
• [文献書誌] Saito A,...Gejyo F,...et al.: "Bioengineered implantation of megalin-expressing cells : A potential intracorporeal therapeutic model for uremic toxin protein clearance in renal failure."Journal of American Society of Nephrology. 14. 2025-2032 (2003)
• [文献書誌] Yamamoto S,..., Gejyo F: "Glycosaminoglycans enhance the trifluoroethanol-induced extension of β_2-microglobulin-related amyloid fibrils at a neutral pH."Journal of American Society of Nephrology. 15. 126-133 (2004)
• [文献書誌] Yamazaki H, Saito A,...Gejyo F: "Differentiation-induced cultured podocytes express endocytically active megalin, a Heymann nephritis antigen."Nephron. In press. (2004)
• [文献書誌] 下条 文武: "アミロイドーシス 新臨床内科学 第3版(高久 史磨、尾形 悦郎、黒川 清、矢崎 義雄監修、和田 攻、橋本 信也編)"医学書院. 1 (2003)